双酶处理对玉米淀粉链结构和消化性的影响

熊珊珊，缪 铭，江 波，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

双酶处理对玉米淀粉链结构和消化性的影响

熊珊珊1，2，缪 铭1，江 波1，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

研究双酶处理形成慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）的精细结构。采用两种酶（β-淀粉酶的水解作用和转苷酶的转苷作用）对玉米淀粉进行双重处理以期提高慢消化淀粉含量。实验结果发现，经过β-淀粉酶水解后的玉米淀粉再经转苷酶处理，其链长分布、碘吸附作用和消化性能有了显著地变化，并且这种变化随不同的转苷处理时间而有明显差异。原淀粉经过β-淀粉酶处理4h，再经过转苷酶处理24h后的淀粉样品SDS最高含量可以达到13.95%，此时的样品平均链长为12.58，分支密度为7.95%。实验证明酶法改性淀粉可以有效改善淀粉的消化性能。

消化性，链长，分支密度，玉米淀粉

Abstract：Fine structure of slowly digestible starch（SDS） formed during dual-enzymes treatment was investigated.Through the hydrolysis of β-amylase and transglycosylation of transglucosidase，higher amount of SDS could be obtained.The result indicated that the chain length distribution，iodine binding and digestibility of starch samples，which were subjected to different time of transglycosylation following β-hydrolysis，changed obviously.After maize starch being treated by β-amylase for 4h，the highest SDS amount of 13.95%was gained when transglucosidase continued to treat for 24h，the average chain length was 12.58，and branch density was 7.95%.The experiment proved that dual-enzymes treatment could improve the digestibility of maize starch effectively.

Key words：digestibility；chain length；branch density；maize starch

淀粉属于多聚葡萄糖，其分子式通常表示为（C6H10O5）n，n为不定数，可以聚合度DP（degree of polymerization）来表示。淀粉是由直链状和支叉状两种分子组成的，脱水葡萄糖单位间经α-1，4糖苷键连接，称为直链淀粉（amylose）；交叉位置是α-1，6糖苷键连接，其余为α-1，4糖苷键连接，称为支链淀粉（amylopectin）。由于淀粉是人类膳食中主要的碳水化合物，也是人体能量的主要来源，淀粉消化的方式和速度对人体餐后血糖应答有着很重要的影响[1-2]，因此改善淀粉的消化利用有着非常大的研究前景。1992年，英国学者Englyst[3]等提出在体外模拟的条件下依据淀粉的生物可利用性将淀粉分为三类：易消化淀粉（ready digestible starch，RDS），指那些能在口腔和小肠中被迅速消化吸收的淀粉（＜20min），属于快速释放能量的高血糖食品；慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS），指那些能在小肠中被完全消化吸收但速度较慢的淀粉（20～120min），可持续缓慢释放能量，维持餐后血糖稳态；抗性淀粉（resistant starch，RS），指在人体小肠内无法消化吸收的淀粉（＞120min），类似于膳食纤维只能在大肠中被微生物发酵利用。Ao[4]等通过不完全水解淀粉，将支链淀粉侧链（A链与B链）和直链淀粉的长度变短，从而使淀粉的分支密度增加，研究此链结构变化与和淀粉的消化速率之间的关系，发现淀粉的精细结构对淀粉的消化影响很大，而淀粉分支密度的增加和酶处理淀粉的晶体结构与淀粉的慢消化性有密切关系。β-淀粉酶作为淀粉水解酶，能切断α-1，4糖苷键，顺次得到麦芽糖单位，但不能裂开支链淀粉中的α-1，6糖苷键，而转葡糖苷酶（transglucosidase，EC 2.4.1.24）不仅可以催化低聚麦芽糖的水解而且可以催化它的转移反应[5]。之前的研究发现β-淀粉酶在水解4h后得到的SDS含量1.83%，为了得到更大的SDS含量，继续利用转苷酶对该样品进行处理，通过对处理后样品的精细结构与消化性能进行分析探讨，证明淀粉微观结构影响淀粉的消化性能，为酶法修饰重组慢消化淀粉提供充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

普通玉米淀粉 直链淀粉含量为24.6%，河北燕南食品集团有限公司；猪胰α-淀粉酶（A3176） 美国Sigma公司；大麦β-淀粉酶、转苷酶L-500 无锡杰能科生物工程有限公司；异淀粉酶、葡萄糖试剂盒（GOD-POD） 爱尔兰Megazyme公司；纤维素酯微孔膜 0.45μm，海宁市正方过滤设备器材厂；乙酸钠、碘化钾、碘、无水乙醇、无水乙酸等 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

恒温振荡水浴锅 太仓华利达实验室设备公司；5804 R离心机 德国Eppendorf公司；Delta 320台式pH计 瑞士Mettler Toledo公司；ICS-5000离子色谱仪 美国戴安公司；UNICO UV-2012PC型紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉的β-淀粉酶处理 称取8g淀粉，加入92mL去离子水，在95℃水浴下充分振荡20min，冷却至室温，再加入0.5mol/L乙酸钠缓冲液（pH5.2）至180mL，加入5.12μL β-淀粉酶，于55℃水浴中振荡4h后，沸水浴5min灭酶，取18mL反应液，剩余样品冷却后加入2倍体积的无水乙醇，静置，于3000r/min离心10min，将沉淀冷冻干燥，得到淀粉样品简称为BS。

1.2.2 淀粉的转苷酶处理 向1.2.1中取出的18mL灭酶过的反应液中，加入20mL 0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.5），混匀后于95℃水浴振荡20min，冷却至室温后，然后加入0.8mL转苷酶（1U/mL），置于50℃恒温水浴中振荡反应12h，加入2倍体积的无水乙醇，静置，于3000r/min离心10min，将沉淀冷冻干燥。

分别重复1.2.1过程取18mL灭酶过反应液，再依照上述相同条件用转苷酶另处理24、36h，加入2倍体积的无水乙醇，静置，于3000r/min离心10min，将沉淀冷冻干燥。

总共得到三种淀粉样品分别简称为BT1、BT2、BT3。

1.2.3 用Englyst法测定消化性能 取3g猪胰α-淀粉酶加入10mL 0.1mol/L的乙酸钠缓冲液（pH5.2），在烧杯中溶解后4℃离心，取上清液加入1mL糖化酶，混酶配制完成。

称取淀粉样品300mg，加入三角瓶中，添加7.5mL pH5.2的0.5mol/L乙酸钠缓冲液，混匀后在95℃水浴振荡处理20min，冷却至室温后再置于37℃恒温水浴中，待温度平衡后加入0.75mL混酶液，开始振荡反应（转速为150r/min）并准确计时。水解20、120min后，分别取出0.5mL水解液加入20mL 66%乙醇灭酶[3]，静置，离心，然后离心处理后的上清液用葡萄糖试剂盒中的葡萄糖氧化酶（GOPOD）法在510nm波长处测定产生的葡萄糖含量。具体计算公式如下：

式中：m20为淀粉酶水解20min后产生的葡萄糖质量，mg；mFG为酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖质量，mg；m120为淀粉酶水解120min后产生的葡萄糖质量，mg；mTS为样品中总淀粉质量，mg；RDS为慢消化淀粉；SDS为快消化淀粉；RS为抗性淀粉。

1.2.4 淀粉样品的碘吸附及波长扫描 称取2g碘化钾，溶解至100mL pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入0.2g碘，溶解后低温避光保存。

取0.08g淀粉样品，加入到20mL二甲亚砜中，加热使样品充分溶解，从中取1mL样品溶液至100mL去离子水中，混匀后取出0.8mL，再加入20μL碘液，充分混匀后立即倒入比色皿内，在可见光500～800nm的范围内进行波长扫描，得到扫描图形和数据。

1.2.5 淀粉样品的链长分布 参照缪铭[6]等对淀粉的预处理方法，称取淀粉样品10mg，加入0.9mL蒸馏水，充分振荡，95℃水浴加热15min，然后冷却至室温，再加入2.5mL 0.1mol/L的乙酸钠缓冲液（pH4.0），放置于40℃水浴锅中，待温度平衡后，加入5μL异淀粉酶（1000U/mL），于40℃保温振荡24h后，立即取出脱支处理后的样品并沸水浴灭酶。

将得到的样品在10000r/min离心10min，取上清液并稀释，然后用0.45μm的纤维素酯微孔膜过滤，得到的滤液进行离子色谱分析，参照CHANG等人[7]的高效阴离子交换色谱（High performance anion exchange chromatography，HPAEC）分析方法，使用CarboPac PA 200色谱柱分离脱支样品。先用250mmol/L氢氧化钠溶液平衡色谱柱，然后用1mol/L乙酸钠溶液和100mmol/L氢氧化钠溶液以0.5mL/min的流速做样品洗脱液。分析后得到不同聚合度的峰型图。

1.2.6 计算链长分布比例和分支密度 根据HPAEC结果得到的各个DP值峰面积，计算出各链长分布的比例、平均链长和淀粉的分支密度[8]。

2 结果与讨论

2.1 淀粉样品的消化性能

从表1可以看出，β-淀粉酶和转苷酶的处理使得淀粉样品的RDS含量得到降低，说明SDS含量和RS总含量有所提高，得到样品的消化性能有所改善。糊化淀粉的SDS含量仅为0.35%，经过β-淀粉酶水解处理后的BS样品SDS含量达到了1.83%，再经过转苷酶处理12、24、36h后的BT1、BT2、BT3样品整体SDS含量都有了更明显地提高，这一结论与Ao等人[4]用β-淀粉酶和转苷酶处理玉米淀粉后的SDS含量增加的结果相符，说明双酶处理有助于有效改善淀粉消化性质。而且转苷酶酶处理时间长短也影响着淀粉SDS含量，其中BT2样品得到了13.95%的SDS含量，BT3样品的SDS含量为13.5%，略低于BT2，足够的转苷作用可以达到提高SDS的目的，然而当转苷时间过长，会有小幅度的下降。另外，BT1、BT2、BT3样品在转苷作用后，RS含量反而下降。

表1 β-淀粉酶、转苷酶处理的淀粉样品消化性能Table 1 Digestibility of starch treated by β-amylase and transglucosidase

由于淀粉的分支密度和结晶结构是形成SDS的重要因素，通过部分缩短支链淀粉外链和直链淀粉的长度形成高密度的分支链，增加淀粉的分支密度能改变其慢消化性能[9]。根据以上结果推测，BS样品再经过转苷酶的糖苷转移作用，结构又有了新的变化，转苷酶的转苷作用使淀粉产生了更多的分支糖苷键，形成了类似于簇状的分支结构，减缓了消化速率。

2.2 淀粉-碘吸附结合物

碘液与淀粉显色原理是碘分子可以钻入支链淀粉螺旋空隙当中，并借助范德华力与直链淀粉联系在一起，从而形成络合物。这种络合物能比较均匀地吸收除蓝光以外的其他可见光，从而使淀粉变为深蓝色，并且最大峰出现的波长越小，淀粉的链越短，所以淀粉-碘吸附曲线可以在一定程度上反映出淀粉的内部链结构。

从图1可以看出，其中未经过转苷酶处理的BS样品在4个样品中吸光度值最高。显然，经过转苷酶处理后的吸光度值下降了很多，而且最大吸收波长向低值偏移。BT1、BT2、BT3样品的三条波段吸收曲线变化趋势是基本一致的，都在550～575nm出现了最大吸收峰，但三者的吸光度值和最大吸收波长都略有不同：BT1、BT2、BT3的吸光度值依次下降，即转苷酶处理时间越长，吸光度值越小；但最大吸收峰的波长偏移则不同，BT2样品最大吸收波长最小，BT1样品最大吸收波长最大，BT3则居中。

图1 淀粉-碘吸附结合物的可见光吸收曲线Fig.1 Wavelength scanning profiles of starch samples binding iodine

图1表明转苷酶的处理时间长短会影响淀粉碘吸附能力的大小。转苷酶对BS样品的作用中发生了结构的改变，转苷作用从长分支链切下葡聚糖，然后转移形成更多的分支，所以平均链长变短。Xinyu[10]对β-淀粉酶水解的淀粉进行碘吸附，得出淀粉链长的缩短会减弱碘分子的吸附能力的结论，解释了BT1、BT2、BT3样品在图1中表现出比BS样品小很多的吸光度值，而且最大吸收峰明显的往短波长方向偏移，不同处理的时间导致了不同程度的偏移，而这种偏移程度与各自SDS含量的变化是一致的。

2.3 淀粉样品的分支链长分布

图2 BS、BT1、BT2、BT3分别经过HPAEC得到的色谱图Fig.2 Chromatograms of BS，BT1，BT2，BT3after HPAEC

表2 淀粉样品的不同链长部分的面积Table 2 Chain length distribution of starch samples

HPAEC分析得到淀粉分支链长分布，通过其中各个峰的大小可以看出不同聚合度（DP）的链长所占的比例。从表2中的各样品链长分布的变化可以发现，经过不同时间转苷酶处理淀粉的长链与短链分配的比率存在明显的差异，在BS淀粉样品中含有较多中短链（FrⅡ+FrⅢ），转苷酶处理过后的淀粉含有的大部分是短链（FrⅢ）。通常将淀粉分支侧链分为A、B、C三种链，链的末端都具有一个非还原末端。其中，A链是外链，经由α-1，6糖苷键与B链连接，B链又经由α-1，6糖苷键与C链连接，A链与B链的数目大体相等，C链是主链，每个支链淀粉只有1个C链。B链依据侧链各自的长度和跨越的簇的数量，可进一步被分为B1、B2、B3等链。一般来说，A链的聚合度（DP）小于13（最短链），B1链的DP为13～30，B2链的DP为31～50，而B3则更长些[11-12]。因此可以推断出所有样品都含有高比例的A链，其次是B1链，B2、B3链含量都很低，除此之外，转苷酶处理时间越长，短链（FrⅢ）增加的越多，中长链（FrⅠ+FrⅡ）则相应的减少。

2.4 淀粉样品的平均链长和分支密度

表3 淀粉样品的平均链长和分支密度Table 3 Average chain length and branch density of starch samples

由表3可以看出，BT3样品即转苷酶处理36h得到样品的平均链长为11.23，在所有样品中为最小，而BS样品的平均链长最大。由此发现，经过转苷酶处理后的样品，链长在不断下降，而且酶处理时间越久，相对应的样品平均链长越小。另外，相比于BS样品，BT1、BT2、BT3三个样品的分支密度都有提高，且随转苷酶处理时间越长分支密度则越高。以上结果说明转苷酶的处理有效改变了淀粉分子的内部链结构。

将表3的平均链长和分支密度同表1中各样品的SDS含量对照，发现样品中分支密度最高的BT3样品，平均链长最短为11.23，但其相对应SDS含量为13.50%，略低于BT2样品中13.95%的慢消化淀粉含量。由此可说明，样品的分支密度越大，相对应SDS含量不一定越高，它们之间不是呈正比关系，分支密度过高和过低都有可能会出现SDS含量下降，只有将样品的分支密度提高，平均链长下降至一定程度，才能得到最大的SDS含量，这与Zhang[13]等报道分支外链在一定DP值范围内的SDS含量最高的结论相一致。

综上所述，由表1和表3可以充分验证，SDS含量的变化确实和淀粉的内部结构有很大的关系，更准确地说是淀粉链结构的平均长度和分支密度影响了SDS含量，而且正是酶对淀粉的处理才使得淀粉的内部结构发生了变化。当酶的催化糖苷转移作用充分改变了淀粉链长，平均链长变短，分支度增加后，淀粉酶、糖化酶在消化淀粉的时候，受到多分支结构的阻力，减缓了消化速度。如果转苷作用导致淀粉链长过短，消化酶很容易接触到分支键，淀粉会被快速消化成还原糖。

3 结论

双酶处理对淀粉分子的链结构以及其消化性质产生的影响表明，短链不利于结合更多的碘分子，并且可见光吸收的最大吸收波长与淀粉样品SDS含量存在关系；分支密度影响着SDS含量的高低，有效提高SDS含量的方法就是形成多分支短链的簇型结构。所以本实验证明，酶法修饰淀粉可以达到重组淀粉结构，从而改善淀粉消化性能的目的，在食品工业生产中具有广阔前景。

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Effect of dual-enzymes treatment on chain structure and digestibility of maize starch

XIONG Shan-shan1，2，MIAO Ming1，JIANG Bo1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

TS231

A

1002-0306（2012）16-0127-04

2012-01-16 *通讯联系人

熊珊珊（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品加工新技术。

国家自然科学基金项目（20976073，31000764）；江苏省科技支撑项目（BE2010717）；中央高校基本科研业务费专项资金（JUSRP10930）。