南极磷虾脂质提取方法的比较

孙甜甜，薛长湖，薛 勇，左 涛，岳荣岩

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

南极磷虾脂质提取方法的比较

孙甜甜，薛长湖*，薛 勇，左 涛，岳荣岩

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

实验分别比较了氯仿甲醇、正己烷和95%乙醇三种不同溶剂以及超临界CO2提取的南极磷虾脂质成分差异，为南极磷虾脂质的研究提供一定基础。结果表明，氯仿甲醇提取的脂质得率最高，为19.21%±0.59%。正己烷提取的得率最低，仅为14.24%±0.38%，甘油三酯和胆固醇含量最高，分别为46.98%±1.00%和3.68%±0.30%，但对极性脂的提取效果不理想，磷脂含量仅为19.20%±3.45%。95%乙醇提取的脂质磷脂含量35.59%±2.69%，不饱和脂肪酸中EPA和DHA含量是最高的，占总脂肪酸含量的41.13%，且95%乙醇安全性高，价格低廉，适合大规模工业化生产，可以作进一步的探讨。超临界CO2萃取技术作为脂质的一种温和提取手段，得到的脂质基本成分与氯仿甲醇近似，虽然安全性更高，但是超临界设备成本较高，不适于中小型企业工业化生产。

南极磷虾脂质，氯仿甲醇，95%乙醇，正己烷，超临界CO2，成分差异

Abstract：In order to provide certain base for the Antarctic krill lipid research the lipid difference of Antarctic krill by using chloroform methanol，95%ethanol，hexane method and supercritical CO2were discussed.The result showed that the content of lipid using chloroform methanol was the highest，about 19.21%±0.59%.The content of lipid using hexane was the lowest and its triglycerides and cholesterol content was about 46.98%±1.00%and 3.68%±0.30%respectively.But the extraction efficiency of polarity lipid using hexane was not ideal as it contained only 19.20%±3.45%phospholipids.The content of polarity lipid using 95%ethanol was relatively higher which included 35.59%±2.69%phospholipids，and the content of EPA and DHA was the highest which included 41.13%of the total lipids.And 95%ethanol method was more safety and cheaper，so it was suitable for large-scale industrialized production and could be further discussed.The lipid extracted by supercritical CO2technology which was a mild methods for of lipid extraction was approximate with chloroform methanol.Supercritical CO2extraction technology was more secure，but the high cost of supercritical equipment was not suitable for the industrial production of small and medium-sized enterprises.

Key words：Antarctickrilllipid；chloroformmethanol；95%ethanol；hexane；supercriticalCO2；componentdifference

南极磷虾（Euphausia superba），是一种生活在南极洲水域的甲壳类浮游动物，个体较小，一般3～5cm，其生物资源十分丰富，是迄今人类发现的蛋白质含量最高的生物。据测定，南极磷虾肌肉鲜样中含粗蛋白16.31%，不仅含人体所必需的全部氨基酸，而且必需氨基酸之间的比例适宜，更有利于人体吸收，营养价值十分丰富[1]。南极磷虾中还含有丰富的ω-3系列的多不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），还富含常作为功能食品的磷脂类、类黄酮、维生素A、维生素E、虾青素等[2]。从南极磷虾中提取的脂质具有降血脂、降血压、抗氧化、减肥等保健功能。与传统的鱼类脂质相比，南极磷虾脂质在人体中具有更好的吸收性，且经测定，南极磷虾的脂质不会产生任何毒副作用，保健功效更加全面，是一种发展前景十分广阔的功能性食品[3-4]。目前提取南极磷虾脂质主要有以下方法：a.有机溶剂萃取。利用有机溶剂从动植物组织中提取脂质是应用最广泛的方法。南极磷虾脂质的提取多使用乙醇、丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯等毒性较低的有机溶剂。b.超临界CO2萃取法。近年来，超临界萃取作为一种新兴技术受到了人们的重视。CO2具有无毒、价廉易得、临界温度接近室温并且临界压力不太高等优点，成为最常用的超临界萃取溶剂。超临界CO2萃取是一种温和的脂质提取方法，在南极磷虾提取方面还处于研究阶段，而且目前对南极磷虾脂质提取方面的报道较少，本研究主要利用了氯仿甲醇、正己烷和95%乙醇三种不同溶剂及超临界CO2技术提取南极磷虾脂质，比较了不同提取方法得到的脂质成分的差异，为南极磷虾脂质的研究提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾 日本水产株式会社提供，冷冻方式运至实验室，并贮藏于-30℃冰柜，粉碎；甘油三酯试剂盒、总胆固醇试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司；正己烷、氯仿、甲醇、95%乙醇、石油醚、无水硫酸钠、氯化钠、浓硝酸、高氯酸等 均为分析纯。

BS210S型电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；JB-1A磁力搅拌器、721型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；RE52CS型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SFE121-50-02超临界萃取装置江苏南通华兴石油仪器有限公司；6980N型气相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾脂质的溶剂提取 称取三份10g粉碎的南极磷虾，分别加入氯仿/甲醇（2∶1，V∶V）、95%乙醇、正己烷各150mL，浸提温度均为25℃，中等转速搅拌浸提4h。过滤后用少量提取溶剂冲洗滤渣，合并滤液。正己烷和95%乙醇提取后的滤液直接真空旋蒸，操作温度分别为40、45℃。氯仿/甲醇法提取的滤液中要加入35mL的0.9%氯化钠溶液，振荡摇匀后静置过夜，溶液明显分层，收集下层氯仿层，通过无水硫酸钠脱水后移至旋蒸瓶中，于40℃下真空旋蒸。

1.2.2 南极磷虾脂质的超临界CO2提取 本实验采用的是1L超临界CO2萃取装置，该装置所用容器材质均为不锈钢，温度控制采用循环水浴，压力由调节阀控制。称取三份100g粉碎的南极磷虾，采用25MPa的压力，50℃的萃取温度，分别萃取1、2、3h，CO2流量为20L/h，极性夹带剂（如95%乙醇）萃取。收集分离器中得到的液体，过滤除去杂质后滤液于45℃下真空旋蒸。

1.2.3 分析方法 总脂测定：重量法；甘油三酯和总胆固醇测定：试剂盒测定；磷脂含量测定：GB/T 5537-2008第一法钼蓝比色法；游离脂肪酸测定：铜皂比色法[5]；过氧化值（POV值）测定：GB/T 5009.37-2003第二法比色法；脂肪酸组成测定：气相色谱法。

1.3 测定条件

1.3.1 磷脂含量测定条件 取0.1～0.2g提取的南极磷虾脂质，先用20mL混合酸（浓硝酸∶高氯酸=4∶1，V∶V）浸泡，冷消化2h，然后进行湿法消化[6]。将消化好的溶液用超纯水定容至50mL容量瓶中，再采用GB/T 5537-2008第一法钼蓝比色法测定磷脂含量。

1.3.2 游离脂肪酸测定条件 游离脂肪酸测定是采用改良的铜皂比色法，游离脂肪酸与铜离子形成铜皂，经有机溶剂萃取后可进行比色测定，铜皂在715nm附近有较强吸收峰，根据吸光度的大小判断游离脂肪酸的含量。

铜试剂：5g乙酸铜溶解于100mL蒸馏水中，过滤后加入吡啶调节pH至6.1，暗处保存。

标准曲线的测定：取0.5g左右油酸，用氯仿定容至100mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL离心管中，氮气吹干，加入3mL正庚烷溶解，振荡1min后加入1mL铜试剂，振荡2min，静置10min后于715nm处测OD值。绘制标准曲线。

样品测定：称取0.1g脂质，用氯仿定容至50mL，取1mL置于10mL离心管中，氮气吹干，加入3mL正庚烷溶解，振荡1min后加入1mL铜试剂，振荡2min，静置10min后于715nm处测定OD值。根据标准曲线计算脂质中的游离脂肪酸含量（以油酸计）。

1.3.3 气相色谱法条件[7]气相色谱分析：取50mg左右提取的脂质，加入1.5mL的10%硫酸-甲醇溶液，于60℃充氮保护反应30min，待冷却后加入1.5mL石油醚振荡提取，静置10min。取上层石油醚溶液过0.22μm的有机膜，过膜后取1μL做气相色谱分析。

气相色谱条件：气相色谱仪为Agilent 6890N型气相色谱仪，进样口为分流/不分流进样口，色谱柱为INNOWax石英毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm，J&W），检测器采用FID检测器，载气为高纯氮气，流速为1mL/min；进样口参数：进样口温度240℃，分流比10∶1，进样量1μL；FID检测器参数：检测器温度250℃，氢气流速40mL/min，空气流速450mL/min，尾吹气（氮气）流速40mL/min；升温程序：起始温度170℃，以3℃/min升温至210℃，保持30min，单个样品分析过程为43.3min。

1.3.4 得率计算

式中：为得到脂质的质量（g）；为粉碎的南极磷虾质量（g）。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂提取南极磷虾脂质的得率

表1 不同溶剂提取南极磷虾脂质的得率Table 1 Extraction yield of Antarctic krill lipid using different solvents

氯仿甲醇法作为一种标准的定量水产品脂质含量的标准方法，可以把样品中所有的脂溶性完全提取出来，可以作为提取脂质分析的数据基础。从表1中可以看出，氯仿甲醇法提取的脂质最高，95%乙醇和正己烷都是单一性溶剂，根据“相似相溶”原理，95%乙醇仅对极性脂提取效率较高，正己烷仅对中性脂提取效率较高，而氯仿甲醇法对中性脂和极性脂的提取效率均较高，所以这两种溶剂的提取效率不如氯仿甲醇。

2.2 超临界CO2提取南极磷虾脂质的得率

从表2中可以看出，随着萃取时间的延长，脂质的得率在逐渐升高，萃取3h后，提取率达到17.53%±0.28%，与溶剂萃取法的得率相近。

表2 超临界CO2提取南极磷虾脂质的得率Table 2 Extraction yield of Antarctic krill lipid using supercritical CO2

三种溶剂提取得到的脂质均为深红色，不透明。其中氯仿甲醇和正己烷得到的脂质常温下流动性较好。而超临界萃取得到的脂质颜色为深红色，不透明，有轻微的虾味，在40℃下流动性较好。

2.3 不同溶剂提取的南极磷虾脂质成分差异

表3 不同溶剂提取的南极磷虾脂质成分差异Table 3 Lipid composition difference of Antarctic krill lipid by different solvents

从表3中可以看出，氯仿甲醇提取南极磷虾脂质的组成主要以甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸为主，三者含量达到88.49%。95%乙醇是一种极性溶剂，根据“相似相溶”原理，主要对脂质中的极性脂特别是磷脂类提取效果良好，磷脂含量为35.59%±2.69%，但是甘油三酯和总胆固醇相对其他两种方法较低。因为南极磷虾中的磷脂是和EPA和DHA结合型的，所以磷脂含量高的同时EPA和DHA含量也会高。另外，95%乙醇提取时还会溶出一些水溶性物质如蛋白质和其他杂质等，使脂质提取率偏低，还会使游离脂肪酸偏高；正己烷是一种非极性溶剂，对中性脂如甘油三酯、胆固醇的提取效率较高，含量为46.98%±1.00%和3.68%±0.30%，因此流动性也是最好的。但是正己烷对磷脂这类极性脂提取效果不理想，仅有19.20%±3.45%，同时正己烷提取还存在溶剂残留问题。过氧化值是反映油脂酸败程度的一个指标，所以游离脂肪酸高的时候POV值也会相应较大。三种溶剂虽然提取时间一样，但是原料中存在一定的水分，在用95%乙醇提取时可能会发生甘油三酯的水解造成游离脂肪酸偏高，而正己烷和氯仿是一种疏水性溶剂，水分对其提取的影响较小，游离脂肪酸和过氧化值相对较小。

2.4 超临界CO2提取的南极磷虾脂质基本成分

表4 超临界CO2萃取南极磷虾脂质基本成分Table 4 Lipid composition of Antarctic krill lipid using supercritical CO2

从表4中可以看出，随着萃取时间的延长，脂质中的各种成分也在增加。在考虑得率、游离脂肪酸含量、磷脂含量、成本、二氧化碳耗用量等各方面指标，超临界采用25MPa的压力，50℃的萃取温度，萃取2h的效果较好，各方面成分接近于氯仿甲醇法。超临界之后的虾粉还可以作为高蛋白质来源进一步开发利用。

2.3 脂肪酸组成分析

从表5中可以看出，氯仿甲醇法提取的脂质中有45.52%的饱和脂肪酸，其中C16∶0的棕榈酸含量最高，EPA和DHA总含量为31.11%；95%乙醇法提取的脂质中饱和脂肪酸含量为41.76%，EPA和DHA含量相对其他两种方法是最高的，占总脂肪酸含量的41.13%。这是因为95%乙醇对极性脂的提取效果较好，而EPA和DHA主要存在于南极磷虾的磷脂这类极性脂中，在甘油三酯等中性脂中基本不存在，这与Joseph C Gigliotti等人[8]的研究结果是一致的；正己烷法提取的脂质EPA和DHA含量与氯仿甲醇法接近，总含量为32.20%，饱和脂肪酸含量占总脂肪酸的45.15%，比95%乙醇略高一些。超临界CO2萃取得到的脂质脂肪酸成分接近于氯仿甲醇法，这是因为CO2和极性夹带剂的共同作用，将脂质中的中性脂和极性脂较完全的提取出来。南极磷虾脂质的脂肪酸主要组成成分与刘丽[2]和楼乔明[7]等人的研究结果基本相似，但是有一些组分相差较大，这可能与南极磷虾的来源、性别、生长阶段以及捕获季节、地点、加工工艺的不同等有关。

表5 不同溶剂以及超临界CO2提取的南极磷虾脂质的主要脂肪酸组成（%）Table 5 Lipid fatty acid composition of Antarctic krill lipid using different solvents and supercritical CO2（%）

3 结论

氯仿甲醇法虽然提取相对完全，可以作为脂质提取的标准方法，但是氯仿是一种可疑的致癌物，甲醇则会损害视神经，都对操作人员的健康有害。所以氯仿甲醇法一般只是作为实验室脂质提取的一个基础理论方法，不作为工业化生产中的方法。正己烷是一种非极性溶剂，对甘油三酯、胆固醇这类中性脂提取效果很好，所以流动性较好，在一些工业生产中也有应用，但是对南极磷虾中磷脂此类极性脂的提取效率不高，EPA和DHA含量相对较低，同时正己烷是一种低毒性的溶剂，具有高挥发性、高脂溶性和高蓄积性等特性，长期接触的话可能会导致中枢神经系统的病变，并且在脂质中存在溶剂残留问题。超临界CO2萃取技术作为脂质的一种温和提取手段，得到的脂质基本成分与氯仿甲醇近似，不用耗费大量的试剂，生产时间缩短，安全性也更高，但是超临界萃取设备比较昂贵，前期成本较高，所以不适于中小型企业进行工业化生产。从结果来看，95%乙醇提取南极磷虾脂质可以获得相对较高的得率，磷脂含量高达35%，不饱和脂肪酸EPA和DHA含量高达41.132%，而且95%乙醇安全无毒，价格低廉，是十分适合大规模工业化生产的，可以作进一步的探讨。

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Comparisons of the Antarctic krill lipid extraction methods

SUN Tian-tian，XUE Chang-hu*，XUE Yong，ZUO Tao，YUE Rong-yan
（College of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

TS254.1

A

1002-0306（2012）16-0115-04

2012-01-05 *通讯联系人

孙甜甜（1987-），女，硕士研究生，研究方向：水产化学。

国家863计划（2011AA090801）；国家863计划（2011AA100803）；“泰山学者”建设工程专项经费。