高效液相色谱法测定番茄及其制品中番茄甙的含量

张 玉，吴慧明，王 伟，徐丽红，王建清

(1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州310021;2.浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州310029)

高效液相色谱法测定番茄及其制品中番茄甙的含量

张 玉1，吴慧明2，王 伟1，徐丽红1，王建清1

(1.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州310021;2.浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州310029)

建立了固相萃取-高效液相色谱(HPLC)测定番茄及番茄制品中番茄甙的方法。样品中的番茄甙经过甲醇提取，PCX固相萃取法净化，乙酰化后，采用高效液相色谱法进行测定。以乙腈和水(90∶10)为流动相，经过C18色谱柱分离，紫外检测器检测。结果表明:番茄甙的检出限为 0.5mg/kg，方法回收率为90.5%～93.5%，相对标准差为1.7%～3.2%。该方法准确、灵敏、适用于番茄及番茄制品中番茄甙的测定。

番茄甙，测定，HPLC

Abstract:A method was developed for determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography(HPLC).The tomatine in sample was extracted by methanol，cleaned up with PCX solid-phase extraction cartridge，then acetylated by acetic anhydride and determined by HPLC.The mobile phase consisted of 90%acetonitrile and 10%water.The tomatine was separated on C18column and determined with UV detector at 205nm.The results showed:the detection limit of tomatine was 0.5mg/kg，the average recoveries were from 90.5%to 93.5%，and the relative standard deviations(RSDs)was from 1.7%to 3.2%.This method was accurate，sensitive and effective for determination of tomatine in tomato and its processed products.

Key words:tomatine;determination;HPLC

番茄甙又名番茄素、番茄碱，是存在于番茄叶和果实中的次生代谢产物，是一种含有D-木糖、D-半乳糖及两分子葡萄糖的甾体类糖苷生物碱，具有抗菌和驱虫的作用，其含量随着番茄成熟而降低［1］。番茄甙高浓度下具有一定的毒性［1］，因此美国规定新选育的番茄品种必须检测番茄甙的含量。但也有研究发现，一定含量的番茄甙具有降低胆固醇含量，提高免疫力，抗菌等生物活性［1-4］，鉴于其毒性及生物活性，测定番茄及其制品中番茄甙的含量就尤为重要。目前国内外的测定方法有分光光度法［5］，高效液相色谱法(HPLC)［6-8］、气相色谱-质谱联用法［9］等。但分光光度法易受样品中的杂质干扰，而使测定结果不准;气相色谱-质谱联用法需将糖苷水解才能测定，不能直接定量;而高效液相色谱法相对比较简单、准确，但由于番茄甙的紫外吸收较低，用紫外检测器检测灵敏度不高，且易受杂质干扰。因此本研究通过固相萃取纯化样品，提高番茄甙与样品中杂质的分离度，并用柱前衍生法改变番茄甙的紫外吸收能力，提高方法的检测灵敏度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈 色谱纯，德国默克;氨水 分析纯，杭州高晶精细化工有限公司;乙酸酐 分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司;吡啶 分析纯，上海精析化工科技有限公司;番茄甙标准品(tomatine) 纯度大于98%。

Dionex Ultimate-3000高效液相色谱仪 带紫外检测器;分析天平 Startarius，BS223s;KQ-50B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RV10旋转蒸发仪 IKA;TDL-5-A离心机 ANKE;QGC-12T氮吹仪 上海泉岛;HLB固相萃取柱(200mg，3mL)Waters;PCX阳离子交换固相萃取柱(150mg，6mL)、C18固相萃取柱(500mg，6mL)Agela。

1.2 样品制备

将样品用四分法取样或直接放入组织捣碎机中捣碎混匀，制成待测样，放入分装容器中于-18℃保存，备用。

1.3 样品前处理

称取试样5.00g，放入具塞刻度离心管中，用甲醇定容至20mL，剧烈振荡1min后，超声提取15min，离心，取上清液10mL，再加10mL水混匀后，上预先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的PCX阳离子交换固相萃取柱，待样液完全过柱，用3mL 40%的甲醇水溶液清洗柱子，最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL具塞试管中，在50℃下氮气吹干。

1.4 样品衍生化

向试管中加0.2mL吡啶，0.4mL乙酸酐，漩涡1min，盖上塞子，沸水浴50min，取出放入水中冷却后，加10mL 40%的甲醇溶解，溶解液上预先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的C18固相萃取柱，待溶解液完全过柱后，用40%的甲醇5mL清洗萃取柱。而后用5mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，50℃下氮吹干，加1mL甲醇溶解，过0.45μm有机滤膜后待测。

1.5 液相色谱参考条件

色谱柱:waters symetry C18柱，4.6mm ×250mm(5μm);流动相:乙腈∶水(V/V)=90∶10;流速:1.0mL/min;检测波长:205nm;柱温:30℃;进样量:20μL。

1.6 标准曲线绘制

称取一定量的番茄甙，用甲醇配制成质量浓度为1g/L的标准贮备液。吸取适量标准贮备液，用甲醇稀释成100mg/L的标准中间工作液。取标准中间工作液 0.0、0.025、0.050、0.100、0.25、0.50、1.00mL，氮气吹干。进行衍生后，测定。即浓度为0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0mg/L，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

对不同溶剂，即甲醇、乙醇、甲醇∶氯仿(50∶50)提取效果进行比较。经比较发现甲醇对番茄甙的提取效率最高(表1)，因此选取甲醇作为提取剂。

表1 不同提取溶剂对回收率的影响Table 1 Effect of different extraction solutions on recovery

2.2 试样净化方法选择

由于样品中含有较多杂质，影响样品的分离度，因此选取C18、HLB和PCX 3种固相萃取柱进行前处理净化，实验采用标准溶液过柱，然后对3种固相萃取柱的回收率进行比较。表2结果表明PCX固相萃取柱的回收率最好，为96.5%。其他两种固相萃取柱的回收率偏低分别60.5%和45.2%，不适用作为净化方法。随后，对经PCX固相萃取柱净化后的样品进行色谱分析，结果表明经PCX固相萃取柱净化后，能够去除样品中杂质干扰，得到较好的净化效果(图3～图4)。

表2 不同固相萃取柱对回收率的影响Table 2 Effect of different solid-phase extraction cartridges on recovery

2.3 番茄甙衍生条件选择

番茄甙的紫外吸收较弱，直接用紫外检测器测定，灵敏度低。由于番茄甙的糖苷上的羟基，在吡啶存在下，能与乙酸酐发生乙酰化反应，增加双键，增强紫外吸收，因此实验通过对番茄甙进行乙酰化后再测定。为保证衍生充分，采用乙酰化常用的吡啶/乙酸酐(1∶2)作为衍生化试剂，并在前期预备实验中分别加入0.4、0.8、1.2mL乙酸酐进行衍生，结果表明3种体积的乙酸酐对产物含量影响不大，即0.4mL乙酸酐已经过量。因此在接下来的实验中均采用0.4mL乙酸酐进行。

为选择最佳衍生时间，对标准物质分别衍生化20、30、40、50、60、70min 后，测定产物的峰面积。图 1表明，随着时间增长，产物峰面积变大，但到50min时基本稳定，而后略有下降，因此选取50min作为最佳衍生时间。

图1 乙酰化时间对产物峰面积的影响Fig.1 Effect of derivation time on the chromatogram peak area of production

2.4 紫外吸收波长的确立

通过对溶解于甲醇中的番茄甙衍生物紫外吸收扫描，发现在205nm处有最大吸收。因此选择检测波长在205nm处，可确保方法的检测灵敏度。并通过DAD进行光谱辅助定性(图2)。

图2 番茄甙衍生物的光谱图Fig.2 The spectrogram of tomatine derivation product

2.5 仪器条件的选择

选择乙腈和水作为流动相进行样品测定。结果表明样品在乙腈∶水(90∶10)的情况下，番茄甙衍生物与其他杂质能够得到很好的分离(图3～图4)。

图3 标准品色谱图Fig.3 Chromatogram of tomatine standard

图4 番茄样品色谱图Fig.4 Chromatogram of tomato sample

2.6 线性范围与检出限

在0～100mg/L之间，紫外吸收峰面积与番茄甙的浓度具有较好的线性关系，相关系数R2=0.9999(图5)。以3倍信噪比的方法得出，本方法检出限为0.5mg/kg。

图5 番茄甙标准曲线图Fig.5 Standard curve of tomatine

2.7 准确度和精密度

以添加回收率表示方法的准确度，相对标准差(RSD)表示方法的精密度。在不同样品中加入不同水平已知量的标准物质，同时测定样品和加标样品，计算回收率。从表3结果分析，不同添加水平的样品回收率在90.5%～93.5%之间，方法的相对标准差在1.7%～3.2%之间。满足样品检测的要求。

表3 方法回收率和相对标准差(%)Table 3 The recoveries and relative standard deviations of the method

2.8 样品测定结果

采用本实验所建立的方法对不同番茄及番茄制品进行测定，该方法适用于番茄及其制品的测定。对不同成熟度的番茄测定结果表明，随着番茄成熟度增加，番茄甙含量减少;番茄酱样品则未检出番茄甙(表4)。

表4 番茄及番茄酱中番茄甙的含量Table 4 The contents of tomatine in different tomatos and tomato jam

3 结论

综上所述，本实验建立了固相萃取-柱前衍生-高效液相色谱法测定番茄及番茄制品中番茄甙的测定方法。该方法的回收率为90.5%～93.5%，相对标准差为1.7%～3.2%，检出限为0.5mg/kg。该方法具有仪器要求不高，准确度和灵敏度高的特点，适用于番茄及番茄制品中番茄甙的测定。

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Determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography

ZHANG Yu1，WU Hui-ming2，WANG Wei1，XU Li-hong1，WANG Jian-qing1
(1.Institute of Quality and Standard for Agriculture Product，Zhejiang Academy of Agriculture Science，Hangzhou 310021，China;2.Institute of Pesticide and Environmental Toxicology，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

TS255.1

A

1002-0306(2012)15-0322-03

2011-12-15

张玉(1977-)，女，博士，副研究员，研究方向:食品安全检测。

浙江省科技厅重大科技专项(2009C12052)。