基于表面增强拉曼光谱的塑料增塑剂邻苯二甲酸酯定性筛查技术研究

纪丽君，谢云飞，姚卫蓉

(食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122)

基于表面增强拉曼光谱的塑料增塑剂邻苯二甲酸酯定性筛查技术研究

纪丽君，谢云飞，姚卫蓉*

(食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122)

为建立食品中邻苯二甲酸酯(PAEs)类物质的快速筛查技术，本文首先以最受关注的6种PAEs(包括DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP和DNOP)为研究对象，研究了PAEs的拉曼光谱图，得到8个特征峰，并以DEHP为例，采用密度泛函理论(DFT)B3LYP方法，在6-311G(d)基组水平上进行了构型优化和频率分析，对8个特征峰的分子振动模式进行了详细的归属指认。同时，研究了0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和三种PAEs物质混合液的表面增强拉曼光谱(SERS)，并将SERS应用于牛奶实际样品中痕量PAEs的快速筛查，经气相-质谱联用(GC-MS)方法验证结果。结果显示，SERS技术能快速筛查出牛奶样品中痕量PAEs物质，GC-MS验证表明具有很好的准确性，SERS在PAEs的快速定性筛查中具有很好的应用潜力。

邻苯二甲酸酯，邻苯二甲酸-2-乙基己基酯(DEHP)，表面增强拉曼光谱(SERS)，密度泛函理论(DFT)，定性分析

Abstract:Based on surface-enhanced Raman scattering(SERS)，a rapid qualitative analysis method of plastic stabilizer phthalates(PAEs)was established.By analyzing Raman spectra of DEHP，DBP，BBP，DINP，DIDP and DNOP，8 characteristic peaks were figured out，which was further confirmed by theoretical calculation of di-2-ethyl hexyl phthalate(DEHP)by density functional theory(DFT)-the B3LYP method and the 6-311G(d)basis sets.Surface-enhanced Raman scattering(SERS)spectroscopy was realized by Au-nanosubstrate.In addition，qualitative analysis of trace PAEs in milk was performed，and the result was validated by gas chromatographymass spectrometry(GC-MS).The results demonstrated that SERS technology could be developed as a rapid method for screening of trace PAEs in food samples.

Key words:phthalates;DEHP;surface enhancement Raman spectroscopy(SERS);density functional theory(DFT);qualitative analysis

邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)类物质具有类雌激素毒性，可通过空气、水、食物三大途径进入人体，对人体产生内分泌干扰作用。近年来应用非常广泛，最主要的一个用途是作为塑料合成的增塑剂。据世界卫生组织(WHO)估计PAEs的年产量为800万t，其中邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)占50%，每年约有1.8%的DEHP泄露进入环境［1］。研究表明含有PAEs的塑料材料(如聚氯乙烯、聚丙烯等)常与食品直接接触，加上复杂的食品加工、存储和运输过程，PAEs会发生迁移进入食品［2-5］。此外，还有掺伪问题，如2011年，媒体揭露台湾某企业将DEHP作为乳化剂掺入饮料的“增塑剂风波”。欧盟于2007年正式实行的2005/84/EC号指令关注的PAEs是邻苯二甲酸-2-乙基己基酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)等6种［6］。美国消费品安全改进法案(CPSIA)第108条对这6种PAEs有限量标准，要求儿童玩具或儿童护理用品中这6类邻苯二甲酸酯的含量都不得超过0.1%［7］。目前，PAEs的主要检测方法为气相-质谱联用(GC-MS)［2］、气相色谱- 火焰离子化检测器(GC-FID)［3，8］、高效液相(HPLC)［2，9-10］等方法，这些方法复杂且耗时。利用表面增强拉曼光谱(Surfaceenhanced Raman scattering，SERS)快速检测和在线筛查食品中污染物、实时监测食品运输或发酵过程等方面的研究在近年来成为一个新的探索方向。已经有研究将SERS应用于食物中三聚氰胺［11］、多环芳烃［12］等物质的检测。关于PAEs的拉曼光谱仅有少量研究。Norbygaard等［13］用傅立叶变换拉曼光谱研究了环境中常见的22种PAEs的6个共同特征峰，但其未对这些特征峰做进一步的归属研究。Nyquist等［14］假设 PAEs 分子为 C2v点群(具有 C2v对称性，即一个对称轴和两个相互垂直对称面)，根据邻二氯苯分子的振动模型讨论了PAEs分子振动方式并进行了归属指认，但是，并没有模拟PAEs分子的化学模型，然而，PAEs分子中存在两个羧基，具有空间位阻，并不像邻二氯苯那样具有C2v对称性。本文对PAEs进行拉曼光谱特征研究，并结合量子化学理论进行计算，指认特征峰;将基于SERS的快速定性检测技术应用于牛奶实际样品，期望能应用于快速筛查大批量食品或实时在线监测食品生产和运输过程中的DEHP污染物，为食品安全检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP) 国药集团化学试剂有限公司，气相色谱固定液，纯度≥99.0%;邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP) 东京化成工业株式会社(TCI)，纯度＞98.0%;邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP) Sigma Aldrich公司，纯度≥99.0%;二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;乙腈 美国TEDIA公司，色谱纯;超纯水。

KlariteTM-SERS金纳米增强基底 英国Renishaw Diagnostics公司，硅表面刻蚀周期性排列的倒金字塔形状的有序结构后，镀一层100nm的金纳米颗粒，基底大小为6mm×10m，4mm×4mm的活性区域上刻蚀1.8μm开口的倒金字塔形洞，有研究表明在倒金字塔的底部区域存在4个电磁场较强的区域，为热点区域;便携拉曼仪RamTracerⓇ-200-WF-B 美国欧普图斯科技公司，激光光源波长785nm，输出激光功率在0～340mW之间可调，配备液态样品池，光谱范围100～3300cm-1;Renishaw Iniva共聚焦显微拉曼仪 英国Renishaw公司，配备科研级光学显微镜，测量参数选用×50倍物镜、785nm波长的激光光源、功率衰减1%，光谱分辨率为1cm-1;PolarisQ型气相色谱-质谱联用仪 配有AS3000自动进样器，美国Thermo Finnigan公司;1g/6mL LC-C18固相萃取玻璃小柱 德国CNW公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PAEs拉曼光谱采集与特征峰分析 分别取500μL DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DIDP 和 DINP标准品，置于拉曼小瓶中，放入便携拉曼仪RamTracer的液态样品池中，采用785nm激光波长，100mW功率，扫描范围100～3300cm-1，扫描时间1s，扫描3次求平均的扫描条件，依次扫描DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DIDP 和 DINP的普通拉曼光谱。比较分析这6种PAEs的普通拉曼光谱，确定邻苯二甲酸酯类化学物质的共同特征峰，作为PAEs的定性峰。采用 Gaussian 03［15］软件密度泛函理论，B3LYP泛函和6-311G(d)基组，选择邻苯二甲酸酯类中使用量最大、各国食品安全规则最关注的DEHP为研究对象，建立化学模型，对构型优化和拉曼振动光谱进行模拟计算。对比实验拉曼光谱和理论拉曼光谱，对主要特征峰的振动方式进行详细的归属指认。

1.2.2 PAEs混合溶液的配制 将 DMP、BBP和DEHP配制成 0.1mg/kg PAEs混合溶液;并将0.1mg/kg DMP、BBP和 DEHP的二氯甲烷溶液以2∶3∶4(体积比)比例混合配成三种PAEs物质的混合液，PAEs混合液中DMP、BBP和DEHP的摩尔量比约为 1∶1∶1。

1.2.3 扫描PAEs样品SERS 分别对0.1mg/kg DEHP和0.1mg/kg的PAEs混合溶液进行SERS扫描。取20μL样液滴于Klarite金纳米增强基底，自然蒸干。用共聚焦显微拉曼仪扫描干斑，激光源波长785nm，功率衰减为1%。

1.2.4 牛奶样品的预处理 牛奶中提取邻苯二甲酸酯类的方法是按照文献［16］中的前处理方法稍加修改而得的，将过6mL C18固相萃取小柱的流出液等分为两份。实验过程中，为避免容器污染，使用牛奶本来的利乐砖包装盛放样品［1］，使用不锈钢或玻璃材质的离心管和烧杯。对需使用的各种玻璃、不锈钢仪器用二氯甲烷润洗后，在马弗炉里200℃烘2h，以确保测定结果不受干扰。

1.2.5 扫描牛奶样品SERS 取其中一份流出液在水温为60℃条件下氮气吹干，用二氯甲烷定容至0.5mL，取20μL滴在金纳米增强基底上，自然蒸干。用共聚焦显微拉曼仪扫描干斑，扫描条件同1.2.3。

1.2.6 牛奶样品GC-MS分析 取另一份流出液在水温为 60℃条件下氮气吹至 0.5mL，浓缩液过0.45μm一次性微孔滤膜，滤液注入 GC-MS进行分析。

2 结果与讨论

2.1 PAEs的拉曼光谱

PAEs有二十多种，目前，DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP和DNOP为欧盟和美国的法规标准中最受关注的6种PAEs，是食品、玩具、化妆品中的主要监控对象。图1是测得的6种常见PAEs——DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP 和 DNOP 标准品的普通拉曼光谱，容易发现邻苯二甲酸酯类物质具有的共同特征峰 为 403、653、1043、1127、1167、1585、1605、1731cm-1等8个。通过研究拉曼光谱，这8个特征峰主要是源自PAEs的两个特征基团——酯基和邻苯基团的分子振动。

用Gaussian 03软件采用密度泛函理论(DFT)B3LYP方法，在6-311G(d)基组水平上对DEHP建立分子模型进行化学模拟，进行构型优化和分子振

表1 DEHP拉曼光谱主要特征峰的振动模式归属Table 1 Assignment of vibration modes to the main characteristic bands of DEHP

图1 6种常见PAEs的拉曼光谱图Fig.1 Raman spectra of six common PAEs

拉曼光谱，DNOP的谱线经过Origin软件拉基线处理。动频率分析。由于空间位阻效应，DEHP分子的酯基中C=O与苯环不共面，先前研究在对PAEs中最简单的分子DMP进行构型优化时，得出两个C=O与苯环的夹角分别为133.78°和-24.00°，以此夹角为DEHP的初始结构，编写Gaussian 03构型优化的输入文件，得到收敛的构型后，计算得其理论拉曼光谱，结果如图2(a)所示。对比DEHP理论光谱与实验光谱，以1585cm-1和1605cm-1两个特征峰为准，得出两条光谱的校正系数0.9708。理论光谱经过较正之后，与实验光谱在峰位上达到了较高的一致性。由于实验中检测器对光谱高波数响应弱［17］，相较于理论光谱信号，实验光谱在高波数处的振动峰强度较低。

用GaussViews 5.0对DEHP的拉曼光谱计算结果进行分析，参考文献［14］和［18］，对其拉曼光谱主要特征峰的振动模式进行了指认。如表1所示。

2.2 PAEs的SERS分析

利用商业化的大面积有序金纳米增强基底分别对0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和PAEs混合液进行SERS扫描。作为PAEs的溶剂的二氯甲烷易挥发，可缩短实验时间，同时挥发速度又不至太快，可以与金基底材料表面的有序结构实现充分的接触，从而将待测物质带入倒金字塔格子的热点部位，得到良好的谱峰增强效果。实验结果如图3所示。在金纳米基底上，0.1mg/kg DEHP二氯甲烷溶液和PAEs混合液都得了表面增强拉曼光谱，8个主要特征峰均得以增强。

图2 DEHP的理论与实验拉曼光谱对比Fig.2 Comparison of theoretical and experimental Raman spectra of DEHP

图3 0.1mg/kg DEHP和PAEs混合液的增强拉曼光谱Fig.3 Surface-enhanced Raman spectra of 0.1mg/kg DEHP and mixed PAEs

2.3 牛奶中痕量PAEs的定性筛查

意在将SERS方法应用于实际样品的检测。随机选取了3种不同品牌的牛奶，经过前处理后，提取液滴在金基底上的拉曼光谱均具有PAEs的8个特征峰，如图4。与图3中PAEs溶液的SERS图相比，牛奶提取液的SERS图有几处不同。第一，1044cm-1峰前面的1004cm-1处有个很强的拉曼峰，在图3中也有这样一个拉曼峰(强度弱于1044cm-1峰)，推测原因可能是牛奶复杂基质中含有某种物质在1004cm-1处有拉曼峰;第二，656cm-1特征峰前面出现了一个宽峰。除此之外，PAEs的8个特征峰都存在，表明3种牛奶中均含有PAEs。通过GC-MS的检测，这3种牛奶样品中DEHP的含量分别为1.70、1.64、0.67mg/kg，证明了SERS方法在检测这3种牛奶中的PAEs是可行的。

图4 3种牛奶中痕量PAEs的SERS光谱Fig.4 Surface-enhanced Raman spectra of trace PAEs in three bands of milk

3 结论

本文利用拉曼方法对6种常见的PAEs进行检测，利用密度泛函方法得出的理论拉曼光谱与实际实验测得光谱进行了比较。并利用金纳米基底实现对痕量PAEs的定性SERS检测，进一步将SERS技术应用于实际牛奶样品中PAEs的检测，并取得了较好效果。证明了SERS快速检测技术可以用于定性筛查含痕量PAEs污染物的牛奶样品。

SERS技术是集物理吸附、化学模拟、纳米材料合成为一体的跨学科技术。便携拉曼仪器的快速发展，大大推动了SERS技术在实际样品检测中的应用发展。然而，真正将SERS技术应用于实际生产还需要进一步的研究，急需开发重复性好、成本低的SERS基底，实现在线快速检测食品药品中痕量PAEs污染物的目的。

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Rapid analysis of plastic stabilizer phthalates by surface enhancement Raman spectroscopy

JI Li-jun，XIE Yun-fei，YAO Wei-rong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

TS207

A

1002-0306(2012)15-0297-04

2012-02-17 *通讯联系人

纪丽君(1986-)，女，硕士在读，研究方向:食品安全与质量控制。

“十一五”国家科技支撑计划重点项目(2009BADB9B04)。