猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

曹 振，邓小雨，张 倩，倪建强，周 智，遇秀玲，赵德明，田克恭

（1.中国农业大学动物医学院，中国北京 100193；2.中国动物疫病预防控制中心，中国北京 100125）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均能感染。按临床表现的不同，可分为经典PRRS和高致病性PRRS。经典PRRS自1987年首次在美国暴发以来，现已遍及全球各养猪业发达的国家和地区[1-2]，并在上世纪90年代传入我国[3-4]，临床上以妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎等生殖障碍以及各年龄段猪出现呼吸道症状和仔猪断奶前死亡率升高为特征[5-6]。高致病性PRRS于2006年在我国首次暴发[7]，现已蔓延至越南、老挝、泰国等东南亚国家，临床上以高度接触性传播、全身出血、肺部实变和母猪繁殖障碍为特征，仔猪、育肥猪和成年猪均可发病和死亡，其中仔猪发病率可达100%，死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上。

对PRRSV单克隆抗体的研究可为PRRSV快速检测方法的建立提供技术支持，是PRRS研究中的热点之一。本研究采用纯化的PRRSV全病毒作为抗原，通过淋巴细胞杂交瘤技术，获得了高亲和力、高特异性抗PRRSV M蛋白的单克隆抗体，并对单克隆抗体的生物学特性进行了鉴定，为建立基于单克隆抗体的双抗体夹心ELISA、间接免疫荧光试验、胶体金试纸条等快速检测技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒种和细胞

PRRSV HUB1毒株、Marc-145细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞由中国动物疫病预防控制中心保存。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购自GIBCO公司；HAT、HT、PEG1450、弗氏完全和不完全佐剂购自Sigma公司；羊抗鼠IgG（HRP标记）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；胎牛血清购自BIOCHROM公司；免疫球蛋白分型检测试剂盒（SBA Clonotyping System/AP kit）购自Southern Biotech公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Pierce公司；PRRSV抗体检测试剂盒购自LSI公司；猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）抗体检测试剂盒购自IDEXX公司；猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV）抗体检测试剂盒购自北京测迪科技有限公司。

1.3 试验动物

SPF级BALB/c小鼠购自中国药品生物制品检定所实验动物中心[SCKK（京2005-2004）]。

1.4 PRRSV增殖和纯化

将PRRSV接种于Marc-145细胞单层，待70%以上细胞出现病变时收获病毒，反复冻融处理3次，经4 ℃ 5000 r/min离心30 min收集上清，再经40000 r/min超速离心150 min浓缩病毒，用适量PBS浮悬沉淀，测其蛋白含量和病毒TCID50滴度，置-70 ℃保存。

1.5 动物免疫

用纯化的PRRSV蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化均匀后，腹腔及背部皮下多点注射6～8周龄雌性BALB/c小鼠，100 µg/只；2周后用弗氏不完全佐剂进行第二次免疫，间隔2周第三次加强免疫；最后一次免疫2周后采血测血清抗体效价，待效价达1:105以上时进行细胞融合。融合前3天，用100 µg不加佐剂的抗原液进行加强免疫。

1.6 杂交瘤细胞的制备和筛选

将对数生长期的SP2/0细胞和免疫BALB/c小鼠脾细胞按1:10比例在50%聚乙二醇（PEG1450）作用下按文献[8]进行细胞融合。融合后细胞用HAT完全培养液悬浮，加入铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100 µL/孔，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。用间接ELISA和免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）方法对培养上清进行筛选检测，选取OD值高、IPMA显色较深、生长良好且不与正常Marc-145细胞反应的阳性细胞孔，以有限稀释法克隆3次，使克隆孔阳性率达到100%。将筛选的强阳性单克隆细胞进行扩大培养以制备腹水，并将一部分细胞连续传代、冻存，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

1.7 腹水单克隆抗体的制备及纯化

选择10～12周龄BALB/c小鼠，每只腹腔注射灭菌液体石蜡0.5 mL；2～3周后腹腔接种杂交瘤细胞（0.5～1×106个细胞/只），待小鼠腹部明显膨大时采集腹水，3000 r/min离心10 min，腹水上清用亲和层析法纯化，测其蛋白含量和抗体效价，-20℃保存。

1.8 单克隆抗体特性鉴定

1.8.1 单克隆抗体类及亚类鉴定

按照免疫球蛋白分型检测试剂盒说明书进行单克隆抗体类及亚类测定。

1.8.2 单克隆抗体ELISA效价测定

将单克隆抗体细胞上清或腹水10倍系列稀释后，按间接ELISA操作流程进行抗体效价测定。

1.8.3 单克隆抗体IPMA效价的测定

将PRRSV接种Marc-145细胞，待75%细胞出现细胞病变时收获细胞并进行抗原片制备，同时制备正常Marc-145细胞作为对照，将单克隆抗体细胞上清或腹水系列倍比稀释后，按IPMA常规方法进行检测、显微镜观察结果。

1.8.4 单克隆抗体分泌稳定性测定

将杂交瘤细胞连续传代3个月及液氮冻存后复苏，取培养上清检测其抗体ELISA效价，以SP2/0细胞培养液作阴性对照。

1.8.5 单克隆抗体的抗原位点识别分析

将提纯的PRRSV蛋白和Marc-145细胞对照蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转印到硝酸纤维素膜（NC）上用单克隆抗体进行蛋白免疫印迹（Western-Blotting）分析。

1.8.6 单克隆抗体特异性鉴定

将单克隆抗体用购买的PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV抗体ELISA检测试剂盒（二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG）进行检测，以SP2/0腹水作阴性对照。

2 结果

2.1 PRRSV提纯抗原蛋白含量和TCID50效价测定

用蛋白定量试剂盒测定纯化后PRRSV蛋白含量为7.15 mg/ mL，病毒滴度为108.0TCID50/mL。

2.2 杂交瘤细胞株的建立

经间接ELISA筛选和IPMA鉴定，3次亚克隆后获得了2株稳定分泌PRRSV抗体的杂交瘤细胞，命名为3C3、3D2。该细胞株具有双亲代的生物学性质，腹腔接种BALB/c小鼠和体外连续传代3个月均稳定地产生特异性PRRSV抗体，将杂交瘤细胞冻存于液氮中，3个月、6个月、12个月后复苏细胞生长良好，抗体分泌水平未见降低。

2.3 单克隆抗体类与亚类的鉴定

经免疫球蛋白分型检测试剂盒测定，3C3和3D2两株杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型均为IgG2a、kappa链。

2.4 单克隆抗体效价测定

2.4.1 单克隆抗体间接ELISA效价测定

用间接ELISA检测其效价（表1），结果表明两株单克隆抗体的细胞上清效价为103～104，腹水效价为105～107。

表1 单克隆抗体ELISA效价

2.4.2 免疫过氧化物酶单层试验测定

将两株单克隆抗体不同稀释倍数用IPMA试验进行检测，以出现棕黄色至棕褐色判为阳性反应（表2、图1）。结果，杂交瘤细胞培养上清的IPMA抗体效价在1:320以上，腹水的IPMA效价在1:2560以上。

表2 单克隆抗体IPMA效价

2.5 抗体结合位点分析

Western-blotting结果见图2，从图中结果可以看出两株单克隆抗体针对的均为PRRSV 的M蛋白（约19KD）。

2.6 单克隆抗体特异性测定

间接ELISA结果显示两株单克隆抗体只与PRRSV反应，与CSFV、PRV、PPV、PCV均无交叉反应，说明两株单克隆抗体具有良好的特异性。

3 讨论

3.1 单克隆抗体的制备

抗原的纯度是影响单克隆抗体成功制备的关键环节，本研究以纯化的全病毒蛋白为抗原制备单克隆抗体，并对其进行TCID50滴度测定。在免疫小鼠时，考虑到免疫途径、免疫次数与间隔时间都会影响机体的免疫应答能力，我们设计了详细的免疫程序，前三次免疫通过颈、背部皮下免疫，最后一次加强免疫采用腹腔和脾脏注射，使融合前小鼠的血清ELISA效价高达1:105以上，确保了融合效果。

3.2 单克隆抗体的筛选与鉴定

单克隆抗体筛选方法需要满足快速、简便，便于一次处理大量样品等要求，我们用纯化的PRRSV作为抗原建立了间接ELISA技术，一次可以检测大量的细胞培养上清；同时，对ELISA阳性结果再用IPMA方法和商品化PRRSV抗体检测试剂盒进行验证，准确地筛选到两株分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞。对获得的两株杂交瘤细胞进行鉴定，免疫球蛋白亚型均为IgG2a、kappa链。经Westernblotting证明，所得的两株单克隆抗体均针对PRRSV的M蛋白的单克隆抗体。Magar等[9]用单克隆抗体技术鉴定表面PRRSV M蛋白上存在四个连续的表位，两个为美洲型PRRSV特异，一个为欧洲型分离株特异，还有一个在两个基因型中都存在。之后，Yang等[10]制备了一株具有中和活性的M蛋白单克隆抗体，随后又鉴定出了三个不连续性表位，并分别命名为EPORF6A-C，其中EPORF6A和B都可以作为中和抗体的靶标。在本研究中，我们获得了两株抗PRRSV M蛋白的单克隆抗体，为进一步研究M蛋白的抗原表位和中和活性奠定了基础。

3.3 单克隆抗体的生物学特性鉴定

美洲型和欧洲型的PRRSV分离株之间，M蛋白是最保守的蛋白，位于病毒的囊膜上，是病毒主要结构蛋白之一，是感染猪体液免疫的主要对象。研究分析表明，M蛋白是一种免疫原性很好的蛋白质。可诱导产生抗体反应，且在感染后10天即可检出，因此，使用M蛋白作为抗原建立的诊断技术可用于检测各型PRRSV引起的感染。

特异性实验结果表明本研究获得的两株单克隆抗体只与PRRSV反应，与CSFV、PRV、PPV、PCV均无交叉反应；抗体效价检测结果表明，单克隆抗体的腹水ELISA效价最高可达107，IPMA效价可达1:10240；两株杂交瘤细胞经冻存后复苏，细胞生长良好，腹腔接种BALB/c小鼠后可致瘤，并稳定分泌特异性抗体，为PRRS致病机制的研究和快速诊断试剂的开发（如胶体金诊断试纸条、免疫荧光检测、ELISA检测试剂盒）奠定了技术基础。

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