RhoA蛋白在外阴鳞癌组织中的表达及临床意义

张德宇，张士泰，欧阳玲

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

外阴鳞癌（vulva squamous cell carcinoma，VSCC）是外阴最常见恶性肿瘤，多见于老年人，具有生长快、易复发、易误诊或被患者忽视、腹股沟部淋巴结转移早等临床特点，主要死因是转移和局部复发。如果发现一些反应肿瘤侵袭和转移倾向的标记物，用于高危人群的筛选、首次治疗后疗效评估、选择针对性治疗措施、设计相应靶点治疗药物，有效降低临床复发和转移率，将对VSCC的诊断和治疗有着深刻的意义。因此，进一步筛选和检测肿瘤相关标记物是目前外阴癌研究的重要课题之一。Rho家族蛋白是ras家族中最早被克隆出来的蛋白，它们是一组相对分子量为20～25 kDa的三磷酸鸟苷，具有GTP酶活性，被称为Rho GTP酶，研究发现在多种恶性肿瘤中存在Rho GTP酶［1］。RhoA是Rho家族蛋白主要成员之一，具有GTP酶活性，RhoA在细胞内以活化GTP结合形式和非活化GTP结合形式间循环，发挥类似分子开关作用，是细胞内信号转导的桥梁［2］。近年研究表明RhoA在胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达，与这些肿瘤的发生、侵袭及转移密切相关［3～6］。但RhoA在VSCC中有无表达，目前国内外尚无报道。

本研究采用免疫组化技术检测RhoA在VSCC组织中表达情况及其与临床病理因素的相关性，以期为VSCC早期诊断、临床治疗及判断预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

随机收集盛京医院及辽宁省肿瘤医院2006年3月至2011年12月间经病理证实、临床资料完整、有随访记录的40例住院治疗的VSCC组织石蜡标本作为实验组。另选取10例外阴鳞状上皮内肿瘤2级（vulva intraepithelial neoplasiaⅡ，VINⅡ）10例、外阴手术切缘周围正常皮肤10例组织标本作为对照组。所有标本均经10%中性甲醛固定，常规HE制片。实验组：40例患者年龄36～81岁，中位年龄为56岁，对照组年龄44～76岁，中位年龄54岁，两组年龄比较差异无统计学意义。组织学分级：鳞状细胞癌28例，低分化鳞状细胞癌12例，临床分期：Ⅰ期：5例，Ⅱ期：23例，Ⅲ期：8例，Ⅳa期：4例。淋巴结：淋巴结转移癌11例，无淋巴结转移癌29例。治疗方式：实验组和对照组所有患者均采取住院手术治疗，术前均未接受放疗、化疗和生物治疗。组织学分级依据2004年WHO分级标准。临床分期依据FIGO 分期标准［7］。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂：RhoA单克隆抗体，鼠抗人浓缩液（1 mg/mL）纯化抗体购自香港abcam公司。DAB显色试剂盒，PBS缓冲液粉剂，柠檬酸组织抗原修复液粉剂，多聚赖氨酸均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 方法

1.2.2.1 载玻片、盖玻片及组织切片的处理：载玻片放入30%盐酸乙醇清洁液中浸泡24 h，流水冲洗，蒸馏水清洗3遍后浸泡于95%乙醇中6～8 h，晾干；稀释的多聚赖氨酸溶液涂片，60℃烤箱烘干后装盒备用。盖玻片以30%盐酸乙醇浸泡24 h，蒸馏水冲洗3次，无水乙醇冲洗1次，晾干备用。所有石蜡标本组织均4 μm层厚连续切片2张，捞片置于经赖氨酸处理过的载玻片上，65℃烘烤30 min，使组织紧贴于载玻片上，防止脱片。

1.2.2.2 免疫组化染色：免疫组化Supervision二步法［9］。

1.2.2.3 操作步骤：（1）组织切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；PBS洗3次；（2）置柠檬酸盐缓冲液中进行高温高压抗原修复：（3）取一定量pH6.0柠檬酸盐缓冲液1 000 mL于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入己沸腾的缓冲液中，缓冲液没过切片，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，5 min后压力锅离开热源；室温冷却，取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次，放入3%甲醇过氧化氢浸泡 10 min，之后用 PBS 洗 2 次，每次 3 min；（4）切片组织用免疫组化油笔划圈，防止抗体流散，分别滴加一抗；（5）PBS 洗后滴加二抗，室温放置 20 min；（6）PBS洗后DAB显色3～5 min；（7）流水冲洗，苏木素复染；（8）1%盐酸乙醇分化，水洗，PBS 返蓝；（9）95%乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；（10）光学显微镜观察、拍照。（11）免疫组化染色阴性对照：用PBS代替一抗。

1.2.2.4 结果判定：免疫组化半定量［8］：RhoA阳性表达定位于细胞质。结果判断由2位经验丰富但不知受检病例任何临床和病理资料的病理科专业医师，对免疫组化切片进行双盲评估。每张切片选5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，观察肿瘤细胞免疫组织化学染色的情况。评分方法如下：（1）根据细胞染色强弱（记为a）：无着色为0分，浅黄或浅褐色为1分，棕黄或褐色为2分，深褐色为3分。（2）根据阳性细胞百分比（记为b）：1%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%～100%为4分。（3）a与b乘积为IHS评分：0为（-），1～4分为（＋），5～8 分为（＋＋），9～12 分为（＋＋＋）。统计分析时：记（-）为阴性，（＋）至（＋＋＋）为阳性。1.3 统计学分析

所有数据均用SPSS 13.0软件包进行统计分析。用χ2检验等分析法分析RhoA蛋白表达与VSCC患者临床病理因素之间的关系；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSCC组织中RhoA蛋白的表达情况

RhoA阳性表达定位在细胞胞质内呈细小颗粒状，RhoA在正常外阴皮肤中无表达，对照组VINⅡ阳性表达率10%（图1，2）。实验组40例中有31例阳性表达，阳性表达率77.5%，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），图 3，表 1。

2.2 RhoA蛋白与外阴鳞癌临床病理因素的关系

高分化和低分化VSCC组中RhoA蛋白的阳性100%和68.96%，2组比较差异具有统计学意义（表2）。RhoA阳性表达随着临床分期增加而有增强趋势（图4），有淋巴结转移的较无淋巴结转移表达的有所增强（图5）。表达率分别为72%和86%，2组比较差异无统计学意义。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期VSCC组织中RhoA蛋白阳性表达率分别为 20%、78.2%、100%和100%，其中Ⅰ期分别与Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期比较，差异具有统计学意义。Ⅱ期分别与Ⅲ期和Ⅳ期差异无统计学意义，Ⅲ期和Ⅳ期比较差异无统计学意义。有、无淋巴结转移组RhoA蛋白阳性表达率分别为

表1 RhoA蛋白在VSCC组织中表达情况Tab.1 Expression rate of Rhoa protein in VSCC tissue

3 讨论

VSCC占外阴恶性肿瘤的80%～90%，多见于60岁以上妇女。VSCC直接浸润和转移较为常见，有淋巴结转移者手术治愈率仅为30%～40%，预后较差。为防止肿瘤复发、转移，寻求反应VSCC侵袭和转移标记物，是目前该研究领域重要课题之一［8］。

肿瘤的侵袭和转移是一个复杂多步骤过程，已有研究表明细胞因子间的信号转导起重要作用，RhoA是一种小分子GTP结合蛋白，无活性状态时与GDP结合位于细胞质中，受到细胞外刺激时，GDP转变为GTP，RhoA获得活性、转位于细胞膜上而发挥细胞内信号转导作用，活化的RhoA作用于下游效应蛋白 Rho 相关激酶［2，3］。

表2 RhoA表达与外阴鳞癌各临床病理因素之间的关系Tab.2 Relationship between the expression of RhoA protein and clinical pathologic factors

Rho家族蛋白与肿瘤的发生发展多种因素有关，包括肿瘤生长增殖、侵袭和转移，细胞凋亡，肿瘤新生血管生成等［9］。RhoA蛋白是Rho家族成员之一，近年研究发现RhoA在鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，结直肠癌、肝癌等多种肿瘤组织中表达并与疾病发生发展有关［10］。理论已阐明RhoA在肿瘤浸润转移中的作用机制：（1）通过Rho/ROCK活化信号传导通路增强肌动蛋白-肌球蛋白的收缩力，肌动蛋白细胞骨架重组，增强肿瘤细胞运动能力。（2）调节细胞间或细胞与基质间黏附性，促进基质降解。

本研究结果显示RhoA蛋白在VSCC组织中阳性表达明显高于VIN II和正常外阴皮肤组织，2组比较有显著性统计学意义（P<0.01），与林英姿等［11］卵巢癌的研究结果有相似性，提示RhoA蛋白参与了VSCC的发生。本研究结果显示随临床分期的增高RhoA蛋白表达增强（Ⅲ期和Ⅳ期RhoA蛋白的表达明显高于Ⅰ期、Ⅱ期），差异具有统计学意义；在有淋巴结转移组的Rhoa蛋白表达明显高于无淋巴结转移组，差异有显著性统计学意义（P<0.05），此结果与顾颖等［12］在子宫颈鳞癌中的研究结果相似，提示Rhoa蛋白在VSCC发展，浸润及转移过程中过度表达。

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