食物过敏原标准物质的研究进展

周 煌，杨安树，佟 平，袁角建，陈红兵，高金燕

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047;2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047;3.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌330047)

随着社会的发展、人们饮食习惯及食物构成的改变，食物过敏已逐渐成为影响部分人群生活质量和身体健康的一大隐患。食物过敏又称食物不良反应，是人体对某些食物产生的变态反应［1］，可出现多种临床病症，严重的会引发过敏性休克甚至死亡。据相关的流行病学研究表明，食物过敏约影响5%的儿童及3%～4%的成年人的健康，且呈增长趋势［2］。另外，90%的过敏反应由蛋、鱼、贝类、奶、花生、大豆、坚果和小麦等8类高致敏性食物引起［3］。因此，为了有效地预防和控制食物过敏给人类健康带来的危害，食物过敏原的检测、诊断以及治疗已成为国内外研究的热点。毫无疑问，这些研究工作对食物过敏原标准物质的研制提出了新要求［4］。标准物质(Reference Material，“RM”)是指已确定其一种或几种特性，用于校准测量器具、评价测量方法或确定材料特性量值的物质［5］。目前，依照各国际组织和国家实际分类的特点，可将标准物质归纳成三种主要的分类方法:按特性量值学科分类、按标准物质应用领域分类、按标准物质物理形态分类。在我国，按标准物质的应用领域将其分为13类，包括钢铁、有色金属及金属中气体、建材、核材料、高分子材料、化工产品、地质矿产、环境化学、临床化学与药品、食品、煤炭和石油、工程和物理［6］。其中，食品也是其中的一大类。

表1 CREATE项目候选标准物质理化性质分析的参数和所选择的分析方法［22］Table 1 Parameters and selected analytical methods for the physico-chemical characterization of Candidate Reference Materials in the CREATE project［22］

1 食物过敏原标准物质的制备

标准物质是一种实物标准，其种类繁多、应用广泛，在制备过程中，应当选择合适的程序、工艺以及防止污染［7］。根据国家标准物质管理委员会规定，我国一级标准物质研制的全过程包括候选物的选择、标准物质的制备、标准物质均匀性的检验、标准物质稳定性的检验、标准物质的定值、标准值的确定及总不确定度的估计、定值结果的表示和标准物质的包装与贮存，该技术规范适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制(二级标准物质的研制可参照一级标准物质技术规范执行)［8］。然而，与此不同的是，食物过敏原能够引发人体的过敏反应，故在通过一定的实验方法得到高纯度的致敏性蛋白后，在标准物质制备过程中，除理化性质外，还应增加对其免疫学性质的测定。

1.1 食物中主要致敏性蛋白的分离纯化

食物过敏原标准物质按照是否含有基体，可分为含基体的标准物质和不含基体的纯标准物质。含有基体的分析标准物质，如RM 8415(全鸡蛋粉);不含基体的纯标准物质如针对鸡蛋中的某个过敏原蛋白，如溶菌酶。对于不含基体的纯标准物质，蛋白的纯化是前提和基础。目前，常用的纯化方法包括沉淀法、膜分离法、柱层析法和电泳法，而柱层析法包括亲和层析、凝胶过滤层析、疏水相互作用层析、离子交换层析和高效液相色谱。此外，由于生物技术、转基因和基因工程技术的发展，食物过敏原重组技术的研究和发展也越来越受到人们的关注。迄今为止，人们针对某些致敏性食物中的主要过敏原进行了大量的分离纯化研究，尤其是鸡蛋、牛奶、花生这三类高致敏性食物。显而易见，这些研究工作为食物中单一过敏原标准物质的制备奠定了基础。

1.1.1 鸡蛋中主要过敏原的分离纯化 鸡蛋中的主要过敏原包括卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵白蛋白和溶菌酶。其分离纯化的主要研究包括佟平等［9］采用DEAE-sepharose Fast Flow阴离子层析法，得到的卵转铁蛋白纯度高达97%。Dattaa等［10］采用两步膜超滤法，分离得到的卵白蛋白纯度高达98.7%;Chiang等［11］采用两步法，先将蛋清液经膜超滤，再过亲和色谱柱，分离得到溶菌酶，其纯度为96%，总回收率为79%，活力为 70400;Vachier 等［12］用Q-sepharose FF强阳离子柱，一步从蛋清中分离出了溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白三种主要过敏原，其纯度分别为99%、75%和98%。

1.1.2 牛乳中主要过敏原的分离纯化 牛乳中的主要过敏原有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白。对于牛乳中主要过敏原的分离纯化，Konrad等［13］采用超滤膜分离的方法，获得纯度为95%的α-乳白蛋白。蔡小虎［14］则采用过两次离子柱的方法，分离出了β-乳球蛋白，SDS-PAGE鉴定其纯度高达99%，得率为 34.46%。此外，Schlatterer等［15］和 Goodall等［16］则先后对β-乳球蛋白进行分离纯化，其纯度均可达到99%。另外，张艳等［17］对 αs、β-酪蛋白进行分离，得到的αs-酪蛋白与β-酪蛋白纯度分别为83.33%、109.53%。

1.1.3 花生中主要过敏原的分离纯化 Ara h 1～Ara h 11是花生中已确认的11种引起过敏的蛋白。对于花生致敏性蛋白，近年来，研究人员除了研究其天然过敏原的纯化方法外，还进行了基因工程重组的研究。例如，吴序栎等［18］通过硫酸铵沉淀和两步凝胶层析，纯化得到的花生过敏原Ara h 1，SDS-PAGE鉴定其纯度大于90%。张英坤等［19］将花生经脱脂、粗提和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离后，得到Ara h 2的纯度达90%，得率为21.9%。胡纯秋等［20］通过重组，并采用 Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱进一步纯化融合的GST-Ara h 2花生蛋白后，SDS-PAGE显示其纯度约为90%。此外，罗春萍等［21］通过脱脂、浸提、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析分离得到Ara h 6，纯度大于95%，得率为22.5%。

1.2 过敏原蛋白标准物质理化性质的表征

食物中致敏性蛋白理化性质的表征可参照欧盟CREATE项目中所采用的方法。在CREATE中，作为候选过敏原标准物质，在评价其是否可作为标准物质生产前，应对其物理化学性质(见表1)和免疫学性质进行分析，其中，理化性质包括鉴定、纯度、均一性以及二级结构。此外，其稳定性的评定采用的是英国国家生物标准与控制研究所使用的方法，即:先分析冷冻干燥处理对过敏原活性产生的影响，然后将冷冻干燥处理后的致敏性蛋白进行热加速降解处理，以观察其长期的稳定性［22］。

1.3 过敏性蛋白候选标准物质免疫学性质的表征

对引发食物过敏的过敏原，须检测特异性IgE与过敏原的结合能力，其目的是为了得知过敏原的致敏性大小。据文献报导，CREATE项目分析过敏原的免疫学性质主要使用特异性人血清IgE反应。该方法可通过RAST或斑点印迹直接测定IgE的结合能力，也可以采用RAST抑制性实验测定IgE的结合能力，另外，还可通过嗜碱性粒细胞组胺释放实验进一步进行IgE结合能力的评估［22］。

2 食物过敏原标准物质的研究现状

相对而言，国外开展食物过敏原标准物质的研究起步较早。早在20世纪70年代，世界卫生组织和国际免疫学会联合会(WHO/IUIS)就认识到过敏原产品标准化的重要性。1981年，该联合会建立了一个由学术机构和过敏原制造商资助的项目，旨在生产能够获得世界卫组织所认可的过敏原提取物，并以此作为国际标准(IS)［22］。近年来，在食物过敏原蛋白标准化方面，国内外进行了大量的研究，并组建了有关食物过敏的专门研究机构，如美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)。此外，还启动了一些重大项目，如欧盟资助的EuroPrevallProject和CREATE Project。在我国，针对食物过敏及其标准化的研究，则主要集中在高校和科研机构，且刚刚起步。

2.1 国外食物过敏原标准物质研究的重要机构和重大项目

2.1.1 美国国家标准与技术研究院(NIST)NIST是美国商务部直属的一个研究院，成立于1901年，其主要任务之一是提供标准物质和标准参考数据。迄今为止，NIST提供了1200多种标准物质，其中也包括致敏性食物标准物质，包括RM 8415(全鸡蛋粉)、RM 8435(全牛奶粉)、RM 8418(小麦蛋白粉)、RM 8436(硬质小麦粉)、RM 8437(硬红小麦粉)、RM 8438(软小麦粉)和 RM 8414(牛肌肉粉)(http://www.nist.gov/index.html)。从用途来看，这些标准物质都是用于评价分析方法和校准分析仪器，且主要用于测定其中的主要、次要和微量元素成分，而并非用于校准检测食物过敏原的ELISA分析方法［23-24］。

到目前为止，RM 8445(全鸡蛋粉)是制备出的唯一一个用于食物过敏原检测的标准物质，它是由美国食品药品管理局(FDA)、食品协会(FPA)、加拿大卫生部、欧盟标准物质与测量研究所(IRMM)和美国内布拉斯加大学食物过敏研究和资源项目共同生产的一个标准物质，该标准物质经FDA包装并由NIST发布。此外，NIST还希望通过这些组织的合作，研制出其它用于过敏原检测的标准物质［25-26］。RM 8445是一种经喷雾干燥制成的含多种致敏性蛋白的全鸡蛋粉，与鸡蛋中的单个主要过敏原标准物质相比，RM 8445的优点在于更符合食品工业加工中实际所用的原材料，更具实用性。

2.1.2 EuroPrevall Project EuroPrevall Project是一个欧盟资助的多学科综合研究项目，始于2005年，该项目包括17个欧洲成员国、67个合作伙伴、15个临床组织和6个小中小型企业(SMEs)以及在欧洲先进的过敏研究机构，致力于研究“欧洲食物过敏的基本原理和发病率”(http://www.europrevall.org/)。之后，新西兰、澳大利亚、俄罗斯、印度和中国也参与了该项目［27］。此外，EuroPrevall还强调对整个欧洲的食物过敏原进行有效的管理，并研究食物过敏的社会经济学影响［28］。该项目主要研究如何生产及测定高质量的食物过敏原，其目的主要是将其用于诊断食物过敏。此外，该项目还研究不同的加工方法对食物致敏性的影响。

通过对大量食物过敏原信息的收集，EuroPrevall建立了一个食物过敏原数据库 http://www.europrevall.org/。迄今为止，自该项目实施后，已从植物或动物性食物来源中纯化出了46种食物过敏原，并全面表征了其结构、免疫学性质并评估了其致敏性，其中也包含鸡蛋、牛奶和花生中的主要过敏原［29］。而在 EuroPrevall数据库建立前，国际上还出现了一些其它过敏原数据，例如，过敏原在线(http://www.allergenonline.org/)和国际免疫学会联盟(IUIS)过敏原数据库(http://www.allergen.org/)。国际免疫学会联盟数据库为过敏原提供了系统命名法，并由过敏原命名小组委员会授予官方称谓［30］。这些数据库的建立为广大食物过敏原及其相关研究的学者提供了有关食物过敏原的相关信息。毫无疑问，在食物过敏原标准物质的研究阶段，这些数据库所提供的信息将为食物过敏的诊断及食物过敏原的标准化提供有力的支持。

2.1.3 CREATE Project 欧盟资助研究过敏的另外一个重大项目CREATE，始于2001年。该项目成立的目标有两个:a.生产标准化的天然和重组主要过敏原候选有证标准物质，并应达到一定的标准，这些标准包括获得国际相关组织的认可、过敏原含量已知、具有较高的纯度以及良好的理化和免疫学性质;b.确认夹心ELISA为主要过敏原检测的方法，并在此基础上对主要过敏原的含量进行量化［31］。

迄今为止，CREATE项目共研发了18种过敏原，包括8种天然过敏原和10种重组过敏原。rBet v 1、rPhl p 1、rPhl p 5a 和 rPhl p 5b、rOle e 1、rDer p 1、rDer p 2、rDer f 1和rDer f 2是其代表性的重组过敏原分子。研究表明，通过比较重组过敏原与其天然过敏原的理化和免疫学性质，有3个重组过敏原与其对应的天然过敏原有很大的相似性，分别是重组白桦树花粉过敏原(rBet v 1)、重组梯牧草花粉过敏原(rPhl p 5a)和重组屋尘螨过敏原(rDer p 2)。随后，欧洲药品和医疗质量局生物制品标准化计划BSP090，对GMP条件下生产的rBet v 1进行了一系列理化和生物学性质的表征，研究证实，重组过敏原rBet v 1与其对应的天然过敏原具可比性，并进一步证明了rBet v 1可作为Bet v 1的候选标准物质［32］。

虽然，CREATE项目所研究的不是食物过敏原，而主要是花粉和屋尘螨等过敏原标准物质的制备，但同样作为致敏性蛋白标准物质的研究，其制备方案可为未来天然和重组食物过敏原标准物质的研制提供参考。

2.2 国内食物过敏原标准物质的研究现状

我国尚无针对食物过敏原蛋白的标准物质，但我国在蛋白质标准物质的研制方面已积累一些经验，为我国食物过敏原蛋白标准物质的研究提供了良好的技术支撑。例如，中国计量科学院研发了3个浓度水平的牛血清白蛋白溶液标准物质和2个浓度水平的糖基化血红蛋白标准物质。另外，卫生部北京医院研制出了氰化高铁血红蛋白标准物质［33］，北京出入境检验检疫局技术中心研制出了金黄地鼠羊瘙痒病理性朊蛋白标准物质［34］。此外，我国在食物过敏研究方面，已成立了一些科研团队，例如，本实验室在食物过敏方面进行了大量的研究，尤其在鸡蛋、牛奶和花生过敏原的分离纯化方面取得了显著的成果。

由此可见，国内有关食物过敏的研究相对滞后。我国未来在食物过敏原标准物质研究方面的发展，除应提高自身的科研能力外，还应加强与国际研究机构的沟通与协作。

3 结语

食物过敏是世界性难题，为了防止消费者误食过敏性食物，美国、日本和欧盟都都颁布了食物标签法，要求对食品中的8大类食物过敏原进行标注［35-36］。这一目标的实施需要对过敏原进行检测，而且依赖标准物质准确检测过敏原的种类和含量。通过以上综述，可以看出:a.考虑食物复杂基体的影响及食物中某一主要过敏原纯化的研究成果，食物中单一过敏原的标准化比对某种致敏性食物的标准化更容易实现，尤其是鸡蛋、牛奶和花生这三类致敏性食物;b.重组过敏原为食物过敏原标准物质的制备开辟了一条崭新的途径。

总之，随着科学技术的发展以及人们探索的不断深入，食物过敏原标准物质的研究将迈向一个新的台阶。

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