高效液相色谱法测定浓缩果汁及水果果糖中羟甲基糠醛

孔祥虹，李小军，何 强，高军刚，吴双民

(1.陕西出入境检验检疫局，陕西西安710068;2.陕西师范大学，陕西西安710062)

羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde，5-HMF)是葡萄糖、果糖等单糖化合物在高温或弱酸性条件下脱水产生的酚醛类化合物，其为黑色，具有难闻气味，是引起食品风味和褐变的指标成分之一。它常存在于浓缩果汁中，是己糖在高温或酸性等条件下发生美拉德反应和热降解反应(即焦糖化褐变)脱水产生的［1］。若5-羟甲基糠醛浓度偏高，表明加工过程中受到过度加热，果汁的色值变小，口感变差，因此它也被认为是评价果汁品质的重要标志之一［2］。5-羟甲基糠醛具有多方面的对人体有害的生理作用而受到广泛关注，有报道称，它对眼睛、黏膜、皮肤均有刺激性，过量食用会引起中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害［3］。近年来，我国苹果、梨、葡萄等果汁产业发展迅速，浓缩苹果汁年产量约65万t，其中约有90%用于出口，占世界浓缩苹果汁的30%，已成为世界浓缩苹果汁的主要生产国和出口国。目前，国际上对果汁中5-羟甲基糠醛的含量无统一的限量规定，欧盟果蔬汁饮料工业协会(AIJN)规定果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为20mg/L;国际果汁加工联合会(IFFJP)建议果汁中5-羟甲基糠醛的最大残留限量为5～10mg/L，浓缩果汁中最大残留限量为25mg/L［4］。目前，5-羟甲基糠醛的测定方法主要有紫外分光光度(UV)法［5］、高效液相色谱(HPLC)法［6］、高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法［7］等。UV法灵敏度和准确性相对较低，HPLC法样品前处理简单灵敏度和相对较高，而HPLCMS/MS法仪器昂贵，难以普及。以往的研究多集中于高效液相色谱法测定黄酒［8］、牛乳［9］、酱油［10］等食品中的5-羟甲基糠醛，但未见HPLC法检测浓缩苹果汁及浓缩水果果糖中5-羟甲基糠醛的报道，本研究在HPLC法的基础上建立一种能够快速、准确测定浓缩果汁及水果果糖中5-康甲基糠醛的有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浓缩果汁、水果果糖(浓缩果汁中提取出来)购自陕西某果汁厂;5-羟甲基糠醛标准品 德国Dr公司;甲醇 HPLC级;其他试剂均为分析纯。

2695e型高效液相色谱仪、2489UV/Visibie紫外检测器 美国Waters公司;Milili-Q Advantage A10/Elix超纯水系统 法国Millipore公司。

1.2 对照品溶液的制备

取5-羟甲基糠醛标准品25.0mg，精密称定，置于50mL棕色容量瓶中，以10mL甲醇溶解后，用水稀释定容至50mL，配成0.50mg/mL的标准储备液，并用水稀释配制成不同浓度的标准工作液。

1.3 供试品溶液的制备

准确称取试样5g(精确至0.001g)，置于50mL烧杯中，加入10mL甲醇溶解，并转移至50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，充分混匀。取少量样液过0.45μm的滤膜，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱:Inetrsil ODS-3 C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相∶甲醇-水(8∶92，V/V)，流速 1.0mL/min，检测波长:282nm，柱温:35℃，进样量:10μL。

1.5 5－羟甲基糠醛的定性、定量分析

根据5-羟甲基糠醛的保留时间进行定性分析。定量分析采用外标法定量，依次配制不同浓度的5-羟甲基糠醛标准溶液进样分析，以质量浓度(mg/L)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到浓度与峰面积的线性关系，利用线性方程及稀释倍数计算定量结果。

2 结果与讨论

2.1 检测条件的确定

2.1.1 流动相和流速的选择 流动相考察了水-甲醇、0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇、0.01mol/L乙酸铵溶液-甲醇，作流动相时的分离效果。结果表明，磷酸二氢钾和乙酸铵使色谱峰出现拖尾现象，而且盐会损坏色谱柱而导致柱效降低、基线严重漂移，故选定水和甲醇为流动相，通过调整流动相的比例发现，使用甲醇-水(8∶92，V/V)时(如图 1～图 2)，5-羟甲基糠醛峰形和分离度均可达到要求。此外，对比0.8、1.0、1.5mL/min 3种流速效果后，最终选定1.0mL/min为最佳流速，可获得比较理想的分离效果及合适的分析时间。

图1 5-羟甲基糠醛标准色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 5-HMF standard

图2 浓缩苹果汁中5-羟甲基糠醛的色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF in sample

2.1.2 色谱柱和柱温的选择 5-羟甲基糠醛属于中等极性化合物，为了分离度和锋形的改善，本方法分别采用 Diamonsil C18色谱柱(250mm ×4.6mm，5μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm ×4.6mm，5μm)和 Inetrsil ODS-3 C18色谱柱(250mm ×4.6mm，5μm)柱进行分离实验，发现Inetrsil ODS-3 C18色谱柱，可以较好的分离样品中的5-羟甲基糠醛。比较了25、30、35℃时5-羟甲基糠醛的色谱图，发现柱温在35℃时峰形比25、30℃时的较好。

2.1.3 进样量的选择 通过比较进样量分别为5、10、15、20μL 的分离效果发现，当进样量过大时，色谱峰会出现拖尾峰或者前延峰，而且分离效果不佳。若进样量太少，响应低，检测不到，所以最终确定进样量为10μL。

2.1.4 色谱条件的确定 由以上实验，最终确定的色谱条件是:检测波长:282nm，柱温:35℃，进样量为10μL，流动相为甲醇-水(8∶92，V/V)。

2.2 分析方法评价

2.2.1 标准曲线 分别吸取适量的5-羟甲基糠醛标准储备溶液至50mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，配成 1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L 标准工作溶液，每个浓度分别进样2次，以5-羟甲基糠醛的平均峰面积与标准溶液中物质的含量制作标准曲线(见图3)，并计算相关系数。得到的线性回归方程为 Y=65594X+14305，r=0.9998，结果表明，在1.0～25.0mg/L范围内，5-羟甲基糠醛的质量浓度与峰面积具有良好的线性关系。

图3 5-羟甲基糠醛标准曲线Fig.3 The standard curve of 5-HMF

2.2.2 精密度实验 结果见表1。取同一标准工作溶液，在相同的色谱条件，重复进样6次，测得标准工作溶液中5-羟甲基糠醛峰面积，计算5-羟甲基糠醛峰面积的相对标准偏差(RSD)1.19%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性实验 取同一批样品共6份，按1.3节的方法制备样液，得到样液按2.1.4项下的色谱条件测定，结果测得5-羟甲基糠醛的平均含量为9.46mg/L，RSD为1.63%(n=6)，表明分析方法重复性良好。

2.2.4 加标回收率和检出限 选择同一浓缩苹果汁和浓缩梨汁样品，分别加入一定量5-羟甲基糠醛标准液进行加标回收实验，按1.3节方法处理，依法测定，计算回收率结果见表1。在信噪比(S/N)=3∶1，进样体积10μL时，浓缩苹果汁、浓缩梨汁、水果果糖中的5-羟甲基糠醛的检出限均为0.2mg/kg。

表1 5-羟甲基糠醛平均的回收率(n=6)Table 1 Average recoveries of 5-HMF(n=6)

2.5 试样检测

利用本文建立的方法对陕西某果汁厂提供的10份样品进行检测，该方法对这些样品均具有良好的适用性，色谱无干扰，在所检样品中均未超过国际果汁加工联合会(IFFJP)建议的果汁中最大残留限量。

3 结论

本文建立了高效液相色谱法测定食品中5-羟甲基糠醛。该方法具有样品前处理简单快速、分离度高、回收率高、重复性好和适用性良好等特点，满足浓缩苹果汁、浓缩梨汁和水果果糖中5-羟甲基糠醛的测定要求，可作为快速测定浓缩苹果汁等产品中5-羟甲基糠醛的方法。

［1］周福富，廖爱国，刘风景，等.不同因素对5-羟甲基糠醛含量的影响［J］.中国药业，2008，17(19):44-45.

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［4］周克权，王君，刘秀梅.苹果汁中展青霉素和羟甲基糠醛的高效液相色谱测定方法［J］.中国食品学报，2003，3(3):24-29.

［5］冯红伟，扶雄.紫外分光光度法测定糖蜜中5-羟甲基糠醛含量［J］.食品工业科技，2010，31(3):365-366.

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［7］王云凤，常春艳，葛宝坤，等.饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的液相色谱-质谱测定方法［J］.中国卫生检验杂志，2007，17(5):841-842.

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