体积排阻色谱法检测啤酒生产过程中的糖类化合物和发酵产物

李 梅，董建军，尹 花，郝俊光，余俊红，杨 梅

(啤酒生物发酵工程国家重点实验室(筹)，青岛啤酒股份有限公司，山东青岛266034)

麦汁中含有大量的寡糖、麦芽三糖、双糖和单糖。麦芽四糖以上的寡糖不能被酵母所利用，但这部分糖是构成啤酒酒基的重要成分，对啤酒的泡沫和风味具有重要意义。而麦芽三糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等可发酵性糖将会对啤酒的发酵过程和最终风味产生重要影响。麦汁中各种可发酵性糖的绝对含量和相对比例，都是需要考虑和控制的关键因素。如果葡萄糖含量过高，不提高酯类化合物的含量等［1-3］。所以，糖类化合物是啤酒生产过程的重要参数。目前国内对于食品中糖类化合物的液相色谱检测大多采用氨基柱法［4-5］。这是一种成熟可靠的糖分析方法。缺点是要使用高比例的乙腈作为流动相，乙腈毒性很强，氨基柱法将产生大量的有毒废液，不利于环保。而且氨基柱本身很脆弱，容易失效，更换频率较高。此外，氨基柱法无法检测麦芽四糖以上的寡糖和糊精。此外，还有文献利用反向色谱柱检测啤酒中 DP1-DP3可发酵性糖［6-8］，但是分离效果较差，无法准确定量，这是因为C18的填料对糖类化合物的保留很弱。本文采用兼具体积排阻性质和离子交换功能的糖分析柱，以超纯水加入少许硫酸作流动相。因为不添加有毒的有机溶剂，方法安全、无毒、环保、快速准确。除检测果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖外，还可以检测麦汁、发酵液和啤酒中的麦芽四糖以上的寡糖和糊精，而且可以同时检测乳酸、乙酸、丙三醇和乙醇等发酵产物。此方法也可以作为检测啤酒中碳水化合物的分析方法［9-10］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-(-)-阿拉伯糖(＞99%)、D-(+)-果糖(＞98%)、D-(+)-葡萄糖(＞98%)、D-(+)-蔗糖(＞99%)、D-(+)-Maltose hydrate(＞99%)、麦芽三糖(＞96%)、麦芽四糖(＞96%)、麦芽五糖(＞95%)、麦芽六糖(＞95%)、麦芽七糖(＞94%)、Acetic acid(≥99.7%)、Lactic acid(≥85%)均由美国Sigma-Aldrich公司提供;乙腈 色谱级，由Burdick＆Jackson公司提供;硫酸(＞98%)由国药集团提供。

6110 Balance电子天平 Sartorius公司;Milli-Q超纯水机;Phenomenex Rezex糖分析柱 ROA300mm×7.8mm(00H-0138-KO);Kromasil NH2柱 250mm×4.6mm;Waters Alliance 2695液相色谱仪、Waters Column Heater Module、Waters 2414示差折光检测器 美国Waters公司。

1.2 色谱条件

色谱柱:Rezex ROA 300mm×7.8mm(00H-0138-KO);流动相:0.005N H2SO4水溶液;流速:0.6mL/min;色谱柱温度:60℃;检测器温度:40℃。

1.3 样品来源和处理方式

所用样品均为各啤酒生产厂的寄送样品。麦汁、发酵液和啤酒样品用0.22μm针筒式水性滤膜过滤后，直接进样。如需保存可以放冰箱冷冻保存，使用前解冻并上下摇匀。

2 结果与讨论

2.1 麦汁、发酵液与啤酒样品分离谱图

麦汁、发酵液与啤酒样品分离谱图见图1。麦芽四糖及其以上的糖包括麦芽四糖～十糖的寡糖、糊精、葡聚糖等，保留时间非常接近，无法完全分离，只能作为一个整体来定量。这部分糖不能被酵母利用，将作为啤酒的酒基影响啤酒的风味和泡沫等其他感官性能。在麦汁中麦芽糖的含量最高，并和蔗糖共流出共同定量。蔗糖、果糖和葡萄糖在发酵时被快速彻底利用，绝大多数的成品啤酒中已经无法检测到这三种糖。麦芽三糖被酵母部分利用，利用程度同菌种和发酵条件有关。丙三醇和乙醇作为发酵的产物会在发酵液和啤酒中大量产生。

图1 麦汁、发酵液和啤酒分离谱图Fig.1 Chromatogram of wort，fermentation broth and beer

2.2 与氨基柱法数据对比及定量方法优化

分别用体积排阻法和氨基柱法检测多批麦汁样品。发现这两种方法的数据有差异(表1)。体积排阻法的数据普遍略高于氨基柱法，尤其是麦芽三糖，要高2～3g/L。因为氨基柱法的麦芽三糖最后出峰，附近没有其它色谱峰干扰，而体积排阻法的麦芽三糖和麦芽四糖及以上糖没有完全基线分离，所以结果偏高。图2是麦汁样品的体积排阻法与氨基柱法的对比谱图。

为了消除这种影响，可以先采用氨基柱法准确定量某一麦汁样品的麦芽三糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量(色谱条件为:Kromasil NH2柱(250mm×4.6mm)，70%乙腈:30%水作流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min)。然后用体积排阻法测定该批麦汁和其它样品，且将此麦汁样品的糖组分数据作为其他样品的定量标准，其中麦芽四糖及以上糖采用体积排阻法的数据，麦芽三糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖采用氨基柱法的结果。因为以麦汁样品作为标准样品比用糖混合标准溶液更接近实际样品的糖含量分布，所以可以更好地消除基线干扰。这批经过准确定量的麦汁样品膜过滤后分装在小离心管里，放在冰箱中冷冻保存，在每次检测时使用，用以衡量检测系统是否稳定。即在日常检测中，该批麦汁样品也兼具控制样品的作用。

图2 麦汁样品在两种方法下对比谱图Fig.2 Contrastive chromatogram of the two methods for wort samples

表1 定量方式优化前数据对比(g/L)Table 1 Data contrast before optimization of quantification(g/L)

表2列出定量方法优化后的结果，可以看出，各组分的差值都很小，两种方法的数据达成了一致。

表2 定量方式优化后数据对比(g/L)Table 2 Data contrast after optimization of quantification(g/L)

2.3 麦汁和啤酒中阿拉伯糖的检测

有文献报道过啤酒中的阿拉伯糖［11-12］。我们用阿拉伯糖标样进行了实验，结果显示麦汁和啤酒中都没有阿拉伯糖检出(图3)。

图3 麦汁、啤酒和阿拉伯糖的对比谱图Fig.3 Contrastive chromatogram of malt，beer and arabinose standard

2.4 进行糖分析的同时检测啤酒中的乳酸、乙酸

在检测糖组分的同时还可以检测乳酸、乙酸(图4)。乳酸和乙酸是两种影响啤酒口味的重要有机酸，也是监控麦汁和啤酒微生物状况的敏感指标，特别是乙酸，由于其阈值很低，仅有50～60mg/L。但是相对于糖类化合物的含量，乳酸、乙酸的含量是极其微量的，糖的单位是g/L，而乳酸、乙酸大都不超过200mg/L。

图4 啤酒样品乳酸和乙酸的检测Fig.4 Detection of lactic acid and acetic acid in beer samples

2.5 方法精密度和灵敏度

对同一个样品连续进样检测9次，计算均值，标准偏差(STDEV)和相对标准偏差(RSD，%)，得到方法的重复性数据，见表3。也可以对同一样品在不同日期检测，得到的重现型数据更有代表性，以反映方法的实际重现程度(表4)。两种条件下的RSD均小于2%。

方法的灵敏度与检测器性能、组份分离和杂质干扰程度有关。保留时间靠前的各组份所受的干扰相对较多，分离程度也不如后面出峰的组份，所以灵敏度相对较低。详见表5。方法的最小检出限在0.02～0.15g/L，最小定量限在 0.06～0.50g/L。

2.6 麦汁和啤酒糖类化合物的检测结果

表6列出了从13°P到22°P麦汁的糖类化合物含量。同样的13°P麦汁，麦芽三糖高，则葡萄糖低，这与糖化酶也叫葡糖酶的使用量有关。加酶量越多，葡萄糖含量越高，麦芽三糖含量越低。表7是啤酒的糖类化合物含量数据。总残余糖为麦芽四糖以上糖、麦芽三糖和麦芽糖含量的总和。

表3 方法的重复性(n=9)Table 3 Repeatability of the method(n=9)

表4 方法的重现性Table 4 Reproducibility of the method

表5 最小检出限和最小定量限(g/L)Table 5 Limit of detection and quantitation(g/L)

表6 麦汁中糖类化合物的含量(g/L)Table 6 Content of carbohydrates in wort samples(g/L)

表7 啤酒中糖类化合物的含量(g/L)Table 7 Content of carbohydrates in beer samples(g/L)

3 结论

相对于氨基柱法，用体积排阻色谱结合离子交换色谱检测啤酒生产过程中的糖类化合物安全无毒、快速、准确。除检测麦汁、发酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖外，还可以检测麦芽四糖以上的寡糖和糊精。且在检测糖类化合物的同时还可以检测乳酸、乙酸、丙三醇和乙醇，是啤酒生产过程控制的有效监控手段。此外，在啤酒和麦汁中均未检出阿拉伯糖。此方法也可以作为检测啤酒中碳水化合物的方法。

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