红景天苷对缺氧诱导培养乳鼠心肌细胞的保护作用

朱 宁， 张 喆， 刘 莉， 陈彦红， 邸雪琴

(1.保定市第一中心医院，河北 保定 071000;2.河北大学基础医学院药理学教研室，河北 保定 071000;3.河北大学附属医院，河北保定 071000)

心血管疾病作为临床上的常见病、多发病，无论是发病率还是死亡率均居各类疾病之首，并已成为目前严重威胁人类健康的最主要疾病之一。常见的心血管疾病如心绞痛、心肌梗死、缺血性心脏病等心脏病患者不可避免的最终结局就是充血性心力衰竭，而这些疾病往往共同的病理生理基础均是心肌缺血［1］。因此，对心血管疾病心肌损伤的病理生理机制及药物治疗靶点的研究成为当今心血管疾病的研究热点。红景天苷 (Salidroside)是常用的藏医中药红景天的有效萃取物之一［2］，红景天是治疗高原病的常用药材，中医传统理论认为其具有固本扶正、益气活血之功效，用来治疗咳血、肺炎、咳嗽与高原缺氧反应等疾病，并认为其滋补强身作用在已知补益药中罕见的，因此红景天享有“东方神草”、“黄金植物”的美誉，是继人参、刺五加之后我国发现的第3种重要的保健药用资源。红景天苷作为其主要有效成分，研究已显示其具有抗缺氧、抗衰老、提高脑力及体力机能等方面作用，本实验采用N2饱和缺氧培养基制备心肌细胞缺氧损伤模型，观察红景天苷对心肌细胞的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及仪器 出生1～2 d健康SD大鼠 (北京维通利华实验动物中心)，99%红景天苷粉剂 (上海英轩生化试剂有限公司)，胎牛血清 (上海微科生化试剂有限公司)，胰蛋白酶 (华美生物公司)，DMEM干粉 (Gibco公司)，SOD检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所)，MDA检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所)，CO2孵箱 (北京吉诺思科贸有限公司)，SW-CJ-2FD型净化工作台 (苏州安泰空气技术有限公司)，SHZ—82恒温水浴振荡器 (北京凯幕生物技术有限公司)，FA21045N型电子天平 (上海精密科学仪器有限公司)，VIS—7220可见光分光光度计 (北京瑞利分析仪器公司)，TS100型倒置显微镜 (日本Olympus公司)，Sunris吸光酶标仪 (瑞士 SUNRIS公司)，JYD—250超声波细胞粉碎仪 (上海京工实业有限公司)，M185706荧光分光光度计 (北京中西远大科技有限公司)，6、24、96孔板 (Costar公司)。

1.2 心肌细胞培养 以Harary的方法为基础略加改动，无菌条件下取出生后1～2 d SD乳鼠心室若干，采用0.08%胰酶消化3～4次，并收集上清液，最后加入含15%胎牛血清的DMEM-F12培养基以终止消化并制成细胞悬液，放入37℃ CO2培养箱内静置培养，根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁55 min，以5×105/mL接种至25 mL培养瓶中，24 h后更换培养液，同时小心洗去除未贴壁细胞，再经24～48 h，待心肌细胞大部分伸展开，连成一片，同步搏动时用于实验。

1.3 缺氧损伤模型的制备 将生长状态良好的培养心肌细胞的培养基倒掉，以预先饱和纯氮气 (99.99%)30 min的N2饱和缺氧培养基冲洗两次，取N2饱和缺氧培养基3 mL加入培养皿中，同时向皿内充氮气20 s置换瓶内空气，置于37℃CO2培养箱备用。

1.4 实验分组与处理 心肌细胞培养72 h换无血清培养基，再培养24 h后经不同处理后置于37℃CO2培养箱培养12 h:①正常对照组:正常培养基培养;②缺氧模型组:N2饱和缺氧培养基培养;③红景天苷低、中、高剂量组:N2饱和缺氧培养基同时加10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L红景天苷共培养。

1.5 检测指标

1.5.1 MDA水平 具体方法参照超氧化物歧化酶测定试剂盒说明书操作。

1.5.2 SOD活性 具体方法参照超氧化物歧化酶测定试剂盒说明书操作。

1.5.3 SERCA活性 将心肌细胞超声裂解后，每组取匀浆液10 μL依次置于6孔板中，每孔加入80 μL反应液 (20 mmol/L HEPES，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，0.01‰TritonX-100，0.8 mmol/L CaCl2，100 mmol/L KCl)，在37 ℃恒温水浴箱预温10 min。每孔再分别加入100 mmol/L对硝基苯磷酸 (pNPP)10 μL，37℃恒温水浴箱中反应30 min;最后加入含55 mmol/L EDTA和500 mmol/L Tris的冷缓冲液1 mL终止反应;在波长410 nm下，测定所有样本的吸光度，根据测得的对硝基苯酚 (PNP)标准曲线求出样本中PNP的生成量。

1.5.4 细胞内 ［Ca2+］i用含15%胎牛血清的DMEM-F12培养基将细胞密度调至3～5×105cells/mL，加入Fura-2/AM，终浓度为5 μmol/L，避光、振摇30 r/min、孵育30 min;1 000 r/min离心5 min，弃上清，用HEPES缓冲液冲洗两遍。每组取细胞悬液1 mL置入荧光光度计检测小室中，发射波长500 nm，激发波长380 nm和340 nm。

1.6 统计方法 计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)，按统计学规定P＜0.05有显著性差异。所有统计分析均使用SPSS 16.0软件计算分析。

2 结果

2.1 MDA水平 与正常对照组比较，缺氧模型组心肌细胞MDA水平明显增高 (P＜0.05)，说明缺氧的心肌细胞脂质过氧化反应明显;与缺氧模型组比较，红景天苷低剂量、中剂量、高剂量组心肌细胞MDA水平均降低 (P＜0.05)，且随着药物剂量的增加，MDA的降低呈一定的剂量依赖趋势，见表1。

表1 各组心肌细胞MDA水平与SOD活性的比较(x ± s，n=8)

2.2 SOD活性 与正常对照组比较，缺氧模型组心肌细胞SOD活性明显降低 (P＜0.01)，说明缺氧时心肌细胞氧自由基清除系统功能下降;与缺氧模型组比较，红景天苷低剂量组SOD活性有增高趋势，但无统计学差异 (P＞0.05)，红景天苷中、高剂量组心肌细胞SOD活性明显增高，有统计学差异 (P＜0.05)，见表1。

2.3 SERCA活性 与正常对照组比较，缺氧模型组心肌细胞内SERCA活性明显降低65%(P＜0.05)，说明缺氧时心肌细胞SERCA活性下降，肌浆网摄取Ca2+能力低下;与缺氧模型组比较，红景天苷低剂量组SERCA活性有所升高，但无统计学差异 (P＞0.05)，红景天苷中、高剂量组心肌细胞SERCA活性明显升高，有统计学差异 (P＜0.05)，提示SERCA活性的增高可能是红景天苷减轻缺氧心肌钙超载的机制之一，见表2。

表2 各组心肌细胞 SERCA活性和 ［Ca2+］i浓度比较(±s，n=8)

注:与正常对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与缺氧模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

组 别 剂量/(mg·mL-1)SERCA活性(μmol·min-1·g-1pro)细胞游离Ca2+浓度/(nmol·L-1)正常对照组 —2.03±0.15 163.81±4.94缺氧模型组 — 0.69±0.02* 289.81±13.69＊＊红景天苷低剂量组 10 0.89±0.03 200.64±6.15红景天苷中剂量组 50 1.34±0.16# 181.82±7.64##红景天苷高剂量组 100 1.57±0.10# 180.35±4.50##

2.4 细胞游离Ca2+浓度 与正常对照组比较，缺氧模型组心肌细胞内［Ca2+］i明显升高了77%(P＜0.01)，说明缺氧时心肌细胞内 ［Ca2+］i浓度增高，存在钙超载;与缺氧模型组比较，红景天苷低剂量组［Ca2+］i有所降低，但无统计学差异 (P＞0.05)，红景天苷中、高剂量组心肌细胞［Ca2+］i浓度均明显降低，具有统计学差异 (P＜0.01)，但两剂量组之间无统计学差异，见表2。

3 讨论

目前氧自由基 (oxygen free radicals)损伤、细胞内钙超载是心血管疾病心肌损伤的发病机理中两种最主要的学说［3］。缺氧的心肌细胞损伤主要包括细胞膜、线粒体及溶酶体损伤三方面的改变［4］。细胞膜是细胞缺氧最早发生损伤的部位。缺氧时，细胞膜离子泵功能障碍、膜通透性增加、膜流动性下降和膜受体功能障碍。许多致病因子作用会造成氧自由基蓄积引起脂质过氧化物水平增高，进一步损伤心肌细胞膜系统［5］。细胞膜通透性增加，Ca2+顺浓度差进入细胞内，肌浆网摄钙速度减慢或摄钙量减少，出现细胞内Ca2+超载，Ca2+进入线粒体形成不溶性磷酸钙，也会加重ATP生成不足，还可以增强Ca2+依赖性蛋白激酶的活性，促进氧自由基生成，进而加重自由基对细胞的损伤［6］。Ca2+超载可激活磷脂酶，分解膜磷脂，使溶酶体膜的稳定性降低，通透性增高，严重时溶酶体膜可以破裂，溶酶体内蛋白分解酶逸出引起细胞自溶，进一步损伤细胞膜和细胞器膜，溶酶体酶进入血液循环可破坏多种组织，造成广泛的细胞损伤［7］。

细胞内外Ca2+稳态的维持依赖于细胞膜Ca2+跨细胞膜转运与细胞内钙库Ca2+释放与摄取的动态平衡［8］。细胞膜Ca2+跨细胞膜转运主要依赖细胞膜Ca2+通道、质膜钙泵(即Ca2+-ATPase)以及Na+-Ca2+交换体。细胞外Ca2+内流的实现主要依赖于细胞膜上的Ca2+通道。目前研究认为细胞膜上主要有4种特异性蛋白质Ca2+通道［9］:渗透通道、机械门控式Ca2+通道、电压依赖式Ca2+通道以及受体依赖式Ca2+通道。调节细胞内外Ca2+分布的另一个重要因素就是细胞内钙库对Ca2+的摄取与释放。细胞器肌浆网富含大量Ca2+，被称之为钙库。目前研究认为，心肌细胞内Ca2+浓度升高90%由肌浆网释放，肌浆网对Ca2+的释放与摄取是引起细胞内Ca2+浓度变化的主要原因。肌浆网Ca2+释放主要依赖IP3受体系统和RyR受体系统，两者均属于受体依赖式Ca2+通道［10］。当心肌细胞兴奋时，细胞膜上电压依赖式L-型Ca2+通道开放，Ca2+顺浓度差由细胞外进入细胞内，但进入的量很少不足以引起肌肉收缩，这些少量的Ca2+可以激活临近肌浆网IP3、RyR受体通道，释放大量Ca2+泵入胞浆，Ca2+浓度迅速升高10倍以上，大量增加的Ca2+与肌钙蛋白C相互作用，肌钙蛋白构型改变，促使肌球蛋白与肌动蛋白结合触发心肌收缩。心肌收缩后胞浆内Ca2+的清除主要通过SERCA泵回到肌浆网或由细胞膜的Na+-Ca2+交换体排出细胞外，从而使胞浆内Ca2+降低，心肌细胞舒张。SERCA的主要功能就是将胞浆内Ca2+摄取入肌浆网。研究发现SERCA有多个异构体，其中SERCA2主要在心肌细胞中表达［11］。

目前红景天苷广泛用于临床治疗心衰、心肌缺血患者，并可提高心肌细胞对外来有毒物质免疫力。有资料证实，红景天苷具有抗心律失常保护心肌作用，并能抑制血管平滑肌细胞的增殖与收缩。动物实验研究显示［12］，红景天苷可以减少H2O2诱导体外培养乳鼠心肌细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)漏出量，抑制脂质过氧化作用，减轻心肌细胞凋亡。前期实验已证实红景天苷可以减少缺氧心肌细胞LDH漏出，并能抑制Ca2+与钙调蛋白(Calmodulin，CaM)结合，来减轻钙超载对细胞的损伤。本研究发现红景天苷可通过提高SERCA活性，增加肌浆网Ca2+摄取功能，减轻细胞钙超载，提示这可能是红景天苷对缺氧心肌细胞保护作用机制之一。

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