小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠PCNA及Reg基因干预作用的实验研究

王志坤， 刘启泉， 李博林， 董林林， 吴云楚， 张晓利， 苏 君

(1.河北省中医院，河北 石家庄 050011;2.河北医科大学，河北石家庄 050011;3.广平县人民医院，河北广平 057650)

胃癌的发生、发展是一个从量变到质变的过程，胃癌前病变 (precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)则是其发生前的一个重要阶段。所谓的胃癌前病变则是指胃黏膜中、重度肠上皮化生和不典型增生，是从正常胃黏膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段。其发生与多基因改变、多因素参与相关［1］。本实验旨在通过观察小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠增殖细胞核抗原 (PCNA)及再生基因I(RegI)表达的影响，进一步从分子和基因水平探讨该方治疗胃癌前病变的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 8周龄清洁级Wistar大鼠 (雄性)100只，体质量120～140 g(购自华中科技大学同济医学院实验动物学部，动物许可证号:SCXR(鄂)2004-0007)。

1.2 药物和试剂 冬凌草10 g、藤梨根15 g、紫豆蔻6 g、黄连6 g、半夏6 g、瓜蒌15 g、当归12 g、白芍15 g、川芎9 g、茯苓15 g、白术10 g、泽泻6 g。所需药物均购自四川新绿色药业科技发展股份有限公司研发的免煎制剂。上述药物用蒸馏水溶解稀释配制成大剂量含药物15 g/mL，小剂量含药物10 g/mL的中药混悬液备用。胃复春片由杭州胡庆余堂有限公司生产，生产批号:1008162，国药准字Z20040003。再生基因I(RegI)单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供。增殖细胞核抗原(PCNA)抗大鼠多克隆抗体，由北京博奥森生物科技有限公司提供。

2 试验方法

2.1 动物分组 将100只大鼠按随机数字表法分为A(空白)组、B(模型)组、C(中药大剂量)组、D(中药小剂量)组、E(阳性对照)组，每组20只，除空白组外，其余各组采用N-甲基-N-硝基N-亚硝基胍 (MNNG)配合饥饱失常诱导造模。

2.2 造模 参考文献［2-3］采用联合造模法。(1)自由饮用MNNG溶液法:将MNNG用蒸馏水配成1 g/L的保存液，避光4℃保存，每日配置100 μg/mL稀释液置棕色瓶中，动物自由饮用。 (2)饥饱失常法:2 d足量喂食，1 d停食，循环实施。并于第1、第3、第5、第7周用无水乙醇2 mL灌胃各一次。共24周。在造模期间，空白组未见死亡，模型组死亡3只，中药大剂量组死亡2只，小剂量组死亡2只，阳性对照组死亡1只。

2.3 给药方法 A组正常喂养;B组予蒸馏水2 mL/d灌胃，每日1次;C组按30 g/kg予小归芍化浊解毒方大剂量混悬液灌胃，每日1次;D组按20 g/kg予小归芍化浊解毒方小剂量混悬液灌胃，每日1次;E组将胃复春以0.5%CMC-Na水溶液配制成适当浓度的混悬液后，按1.4g/(kg·d)灌胃，每日1次。各组共灌胃24周。

2.4 标本采集与处理 末次给药后，禁食不禁水24 h，给予2%戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔内麻醉，处死大鼠，剖胃，沿大弯纵行剪开胃，每只大鼠在胃窦部取材。放置10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。

2.5 观测指标与检测方法 ①再生基因I(RegI):采用免疫组化法染色，严格按试剂盒说明书步骤操作，每张切片随机检测5个视野 (×400)，并按照许良中［4］等方法判读，即染色强度 (SI)和阳性细胞百分率 (PP)的乘积计算免疫反应评分 (immunoreactive score，IRS)，SI计分:0分为无色，1分为淡棕色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;PP计分:0分:阳性细胞率≤5%，1分:6%～25%，2分:26% ～50%，3分:51% ～75%，4分为≥75%;计算 IRS评分:0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性 (+)，5～6分为阳性(++)，7～8分为强阳性 (+++)。②增殖细胞核抗原 (PCNA):采用免疫组化法测定，严格按试剂盒说明书步骤操作，其阳性表达判定参考文献［5］采用显微摄像计算机图像分析系统，每张切片随机检测5个视野 (×400)，计算PCNA阳性细胞数及腺上皮细胞数 (每例＞200个)，求出细胞增殖指数 (PI)。PI=PCNA阳性细胞数/腺上皮细胞总数×100%。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计分析软件，对资料进行分析处理。PI采用±s表示，采用t检验;等级资料采用非参数检验。

4 结果

由表1可见，小归芍化浊解毒方大小剂量组、对照组与模型组比较有统计学意义 (P＜0.05)，均能降低RegI表达量;小归芍化浊解毒方大小剂量组比较有统计学意义 (P＜0.05)，在降低RegI表达量上大剂量组优于小剂量组;小归芍化浊解毒方大剂量组与对照组比较有统计学意义 (P＜0.05)，在降低RegI表达量大剂量组优于对照组。小归芍化浊解毒方小剂量组与对照组比较无统计学意义 (P＞0.05)，尚不能认为小归芍化浊解毒方小剂量组与对照组在降低RegI上有差异。

表1 小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠RegI的影响Tab.1 Effect of Xiaoguishao Decoction on the regeneration gene I in rats with gastric precancerous lesions

由表2可见，小归芍化浊解毒方大小剂量组、对照组与模型组比较有统计学意义 (P＜0.05)，均能降低胃黏膜PCNA表达量;小归芍化浊解毒方大小剂量组比较有统计学意义 (P＜0.05)，在降低胃黏膜PCNA表达量上大剂量组优于小剂量组;小归芍化浊解毒方小剂量组与对照组比较有统计学意义 (P＜0.05)，在降低胃黏膜PCNA表达量小剂量组优于对照组。

表2 小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠PCNA的影响(±s)Tab.2 Effect of Xiaoguishao Decoction on the proliferating cell nuclear antigen in rats with gastric precancerous lesions

表2 小归芍化浊解毒方对胃癌前病变大鼠PCNA的影响(±s)Tab.2 Effect of Xiaoguishao Decoction on the proliferating cell nuclear antigen in rats with gastric precancerous lesions

注:与B组比较，△P＜0.05;与D组比较，☆P＜0.05;与E组比较，□P＜0.05。

组别 剂量/(g·kg-1) 例数PI空白组-20 10.16±1.49模型组 - 17 56.06±3.38中药大剂量组 30 18 23.24±2.94△☆中药小剂量组 20 18 29.63±2.46△□阳性对照组 1.4 19 42.73±3.94△

5 讨论

慢性萎缩性胃炎 (chronic atrophic gastritis，CAG)是消化系统的常见病、疑难病，常反复发作，不易治愈，在其基础上伴发的肠上皮化生和异型增生被认为是胃癌前病变。胃癌的发生通常经历一个相当长的癌变阶段，即胃癌前病变阶段。由于目前对胃癌的各种治疗效果还很不满意，因此防治胃癌前病变及早识别和逆转其向胃癌方向发展有重要意义［6］。胃癌前病变其临床多表现为胃脘隐隐灼痛、痞塞胀满、嗳气、纳呆等症状，属中医学胃痞、胃脘痛等范畴。其发生多是长期六淫伤中，饮食劳倦，情志不遂而伤及脾胃致使脾气亏虚、胃阴不足，中焦失养而发病。本病属本虚标实之证，在本则是脾胃气阴两虚，在标则为湿阻、血瘀、热毒［7］。其中湿浊和热毒是本病的发病及病机演变关键所在。毒为热之极，热为毒之渐，加之脾胃气阴不足，脾失健运，胃腐熟水谷功能失司，则水反为湿，谷反为滞，久则化浊成毒［8］。故浊毒贯穿于疾病之始终。基于此运用化浊解毒的思路，将张仲景当归芍药散与小陷胸汤原方合方加用化浊解毒之药物制成小归芍化浊解毒方治疗胃癌前病变。小陷胸汤辛开苦降、消痞散结，方中重用瓜蒌清热化痰，下气解郁，现代药理研究表明，瓜蒌含三萜皂甙、有机酸、树脂、糖类和色素等，对肉瘤和癌细胞有一定抑制作用;当归芍药散可调节肌体免疫，促进免疫复合物与枯否氏细胞、巨噬细胞的结合［9］。紫豆蔻化浊消痞行气;冬凌草、藤梨根清热解毒、活血消肿、抗癌。诸药合用，使浊邪祛、毒邪解、瘀血活、气血调、壅塞通，从而逆转腺体萎缩、肠上皮化生和异型增生。

增殖细胞核抗原 (PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，存在于细胞核内的一种周期蛋白，PCNA为受体周期所调节的蛋白质，其在S期表达为最大值，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达可作为评价细胞增殖状态的一个指标，也是检测细胞增殖活性最有效的标志之一。研究表明［10］，PCNA在胃黏膜肠上皮化生、异型增生和胃癌中表达呈现递增态势，因此可用于评估肿瘤细胞的增殖性并应用于研究肿瘤增殖状态。再生基因I(RegI)是再生基因家族的成员之一，在肝、胰、胃肠道上皮增生或分化中起重要作用，主要参与组织损伤和肿瘤的发生［11］。研究表明［12］，RegI在胃癌阳性表达率高且RegI阳性的胃癌淋巴结转移多且总体生存率低，另外RegI表达与胃癌的分化程度、浸润性生长以及预后都存在相关性。在胃癌及胃癌前病变过程中，RegI蛋白可作为促生长和抗凋亡因子，RegI阳性的早期胃癌呈现较高的PCNA标记指数，RegI蛋白可抑制H2O2诱导的胃上皮腺癌细胞系 (AGS)的凋亡，因此RegI成为目前观测胃癌发生及预后的一个重要基因。

本实验结果表明，小归芍化浊解毒方能够明显抑制PCNA及RegI基因的表达，从而进一步从实验的基础上证实该方能够阻断并逆转胃癌前病变并能够抑制胃癌的形成。其机理可能与抑制癌变相关基因并降低细胞分裂增生有关。

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