利用重组人α乳清蛋白和油酸大量快速制备高活性的HAMLET肿瘤杀伤复合物

张轶博 曾瑞霞 牛 静 郑少鹏 贾弘禔 丁 卫*

(1.首都医科大学生物化学与分子生物学系，北京100069;2.辽宁医学院免疫与病原生物学教研室，辽宁锦州121001;3.辽宁医学院人体解剖教研室，辽宁锦州121001)

可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human αlactalbumin made lethal to tumor cells，HAMLET)是一种以人源α乳清蛋白为主要成分、可导致肿瘤大量死亡的复合物。HAMLET最初在人乳抑菌效应的研究被偶然发现，继而被证实为一种对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的效应分子［1］。在使用不同细胞系的研究［2］中发现HAMLET具有选择性诱导转化细胞、部分胚胎细胞和淋巴细胞发生凋亡的效应，而对成熟的分化细胞没有显著的毒性作用。进一步的研究［3］表明HAMLET具有广谱的抗肿瘤作用，能够杀伤超过40种不同组织来源的肿瘤细胞系。在动物在体模型和临床预试验［4］中，HAMLET对人神经胶质瘤，皮肤乳头状瘤［5］及膀胱癌［6］等均有较好的疗效，且无明显的不良反应［7］。鉴于HAMLET在肿瘤治疗中的潜在临床应用前景，当前对HAMLET的研究开始关注其结构特点，诱导肿瘤细胞死亡的机制以及其规模化生产流程的优化等方面。

HAMLET［8］或 BAMLET［9］(bovine α-lactalbumin made lethal to tumors)的基本组成为人或牛源的α乳清蛋白(human or bovine α-lactalbumin，HLA or BLA)与油酸(oleic acid，OA)按一定比例复合形成的不均一性分子。Svensson M等［8］通过体外离子交换层析方法获得了HAMLET，并且明确了其作为人乳中的抗肿瘤活性成分。该层析制备方法可得到结构稳定的HAMLET复合物，其活性可在真空干燥后长期保存。但是这种方法制备过程比较繁琐，材料和设备需求复杂，且耗时较长。此后，多个研究小组尝试建立更简易的HAMLET制备方法，多采用脱钙后的apo-HLA与OA在不同的条件下进行共同孵育或直接混合。虽然这些改进的方法也能够产生有活性的HAMLET或BAMLET，但是无一例外对α乳清蛋白的用量和质量需求提出了更高的要求，同时也面临对进一步量产的挑战。

本课题组通过高效原核表达含His标签的重组人HLA蛋白，经NTA金属镍螯合柱一步纯化后，将EDTA除钙离子后的apo-rHLA与油酸水溶悬液直接混合，得到了具有高活性肿瘤细胞杀伤效应的HAMLET复合物;同时对其理化特性和生物学活性进行了较为全面的分析，并且与同类产物BAMLET进行了对比。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

牛α-乳清蛋白纯品、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)购于 Sigma-Aldrich公司;8-苯胺基萘-1-磺酸(8-anilinonaphtalene-1-sulfonic acid，ANS)购自上海生工公司;镍离子亲和层析柱料购自GE公司;BCA蛋白质定量分析试剂盒购于Novagen公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、DeadEndTMFluorometric TUNEL System、MTS试剂盒均为Promega公司产品;鼠抗人His标签抗体购于碧云天公司;IRDye800CW标记的羊抗鼠IgG购于LICOR公司;DAPI细胞核染料购于中杉金桥公司。反转录试剂盒 PrimeScript®RT reagent Kit购自大连TaKaRa公司;Trizol等其余试剂为分析纯产品，购于北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

紫外凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司);Odyssey红外荧光扫描成像系统(LI-COR Biosciences公司);Spectra Max M2多功能分光光度仪(Molecular Devices公司);DM 5000B荧光显微镜以及Leica DMIRB倒置荧光显微成像系统，(Leica公司)。

1.3 人α乳清蛋白的pET30a(+)原核表达载体的构建

MCF-7乳腺癌细胞的总RNA由经典的Trizol法提取，经反转录后获得MCF-7细胞的cDNA文库。通过PCR扩增编码人α乳清蛋白成熟肽链的核酸序列，引物的设计序列为 F:5'-GGGAATTCcatatgAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTG-3';R:5'-CCGctcgag-CAACTTCTCACAAAGCCACTGTTCC-3'，小写序列为酶切位点。扩增片段纯化后经NdeⅠ和XhoⅡ双酶切连接入pET30a(+)质粒，完成带His融合C端标签的人α乳清蛋白原核表达载体的构建，经双酶切鉴定和DNA测序分析证实其序列完全正确。

1.4 重组人α乳清蛋白的表达和纯化

用重组质粒转化BL21大肠杆菌，经IPTG(0.5 g/L)在37℃诱导2 h后，离心收集细菌，并重悬于PBS中。超声裂菌后，高速离心分别得到上清和沉淀。以Gu-MCAC变性缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，6 mol/L guanidine hydrochloride，pH 8.0)溶解富含目的蛋白的沉淀，通过逐滴加入复性缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1.6 mol/L guanidine hydrochloride，5 mmol/L reduced glutathione，0.5 mmol/L oxidized glutathione，pH 8.0)并混匀至500 mL，得到可溶性的复性蛋白。复性蛋白加载至镍离子亲和层析柱，用梯度咪唑缓冲液洗脱，分段收集蛋白样品。定性和定量分析后，将含目的蛋白的洗脱液合并，以ddH2O透析，浓缩后真空冷冻干燥，于-20℃保存备用。

经15%SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和考马斯蓝染色分别对有/无IPTG诱导菌在裂解前/后的不同组分，以及不同纯化阶段的蛋白产物进行检测，确定目的蛋白分布及纯度。

1.5 重组人α乳清蛋白和油酸复合物(rHAMLET)的制备与结构指标分析

重组HLA或BLA溶于1 mmol/L EDTA，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0溶液中，4℃过夜以去除Ca2+。经蛋白超滤管浓缩至2 mg/mL，制成Apo-HLA溶液。在此溶液中逐滴加入OA储存液(210 mmol/L)，并不断涡旋至HLA和OA的摩尔比为1∶15，然后在60℃加热10 min，冷却至室温后离心去除多余OA。溶液经0.22 μm的滤器过滤后为HAMLET，分装保存于-80℃。HAMLET使用前解冻，在60℃预热10 min。

将100 μL 0.2 g/L rHLA，rHAMLET，BAMLET和0.088 g/L OA的0.9%NaCl溶液，分别加入96孔板中，于37℃孵育1 h后，用分光光度计在250～300 nm的紫外谱段下读取扫描A值，并且绘制曲线。

将100 μL浓度为0.1 g/L上述不同样品与超过50倍摩尔浓度的疏水染料ANS混合，在37℃避光结合反应1 h，与蛋白结合后的ANS可在365 nm下被荧光激发，其在400～600 nm区间的发射光谱由Spectra Max M2分光光度计记录，并且通过Soft Max 5.2软件处理绘制光谱曲线。

1.6 细胞培养与形态观察

人乳腺癌MCF-7细胞系，人宫颈癌HeLa细胞系为本实验室冻存，并常规传代。MCF-7细胞和HeLa细胞在5%CO2，37℃条件下，于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养至对数生长期的细胞用于接种和后续实验。

HeLa细胞接种2×104个/孔于12孔培养板(预先加入包被处理的圆形盖玻片)，经5%CO2，37℃过夜培养至细胞贴壁。更换无血清的DMEM继续培养30 min后，加入终浓度为1 g/L BLA，rHLA，0.2 g/L BAMLET，rHAMLET或0.088 g/L OA，1 h后补充加入FBS至终浓度10%，继续培养6 h。在倒置荧光显微镜下观察各处理组的细胞形态变化并采集数字图像。小心将细胞以PBS清洗2次，然后以4%多聚甲醛固定20 min，用PBS重复漂洗2次。用含有DAPI染料的封片剂将铺有细胞的盖玻片安置于载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞及细胞核的形态并采集图像。

1.7 细胞活力试验

HeLa细胞经胰酶消化后，以105个/孔接种于96孔板中，经5%CO2，37℃过夜培养至细胞贴壁。更换无血清的DMEM培养基孵育30 min后，分别将前述不同的处理或对照试剂加入各组样品并混匀。1 h后加入FBS至终浓度为10%。继续培养5 h后，加入MTS试剂，于37℃孵育4 h后，溶解并稀释样本，在波长490 nm下检测光度吸收值(A490)。

1.8 Western blotting分析

超声裂解菌液中原核表达蛋白通过BCA实验进行蛋白定量后，将等量的蛋白由15%SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转至0.22 μm的PVDF膜上。经1.5%BSA室温封闭1 h后，将滤膜与鼠抗His标签的一抗4℃孵育过夜，然后与IRDye800CW标记的羊抗鼠IgG荧光二抗室温孵育1 h。充分漂洗后，经Odyssey成像系统扫描800 nm红外荧光图像并进行分析处理。

1.9 细胞凋亡实验

HeLa细胞接种2×104个/孔于12孔培养板，过夜5%CO2，37℃培养至细胞贴壁。换无血清的DMEM培养30 min，分别加入0.1，0.4 g/L rHAMLET和0.2 g/L BAMLET，1 h后添加FBS至终浓度10%，继续孵育6 h。以4%多聚甲醛固定细胞后，用propidium iodide进行预染色，然后采用Dead EndTMFluorometric TUNEL System试剂盒对处理后的HeLa细胞进行染色，检测细胞的凋亡，具体步骤参照供应商推荐的标准流程。

2 结果

2.1 pET30a-HLA-6×His原核表达载体的构建及鉴定

HLA是一种结合钙离子球形蛋白(图1A)，其种属间的同源物高度保守，并且多种属的晶体结构已经解析。鉴于HLA在人乳腺细胞中高表达，我们从构建的MCF-7细胞cDNA文库中，针对HLA成熟肽编码序列设计引物，利用PCR扩增HLA编码片段，用以构建了pET30a-HLA-6×His原核表达载体(图1B)。所得到的PCR特异性扩增产物大小为392 bp(图1C)。利用限制性核酸内切酶(Nde I和Xhol I)双酶切及T4连接酶反应，将PCR产物克隆到pET30a(+)多克隆插入位点，转化宿主细菌后得到的质粒经酶切鉴定(图1D)和上海生工公司测序分析，插入序列与GenBank中HLA的cDNA编码序列完全一致。

图1 人α-乳清蛋白pET30a(+)原核表达质粒的构建及鉴定Fig.1 Construction and characterization of prokaryotic expression plasmid of human α-lactalbumin using pET30a(+)plasmid vector

2.2 重组人α乳清蛋白的表达和纯化

将pET30a-HLA-6×His质粒转化大肠杆菌BL21后，通过对裂解菌液的蛋白电泳分析，可见在预期相对分子质量处有明显的条带，并且经过IPTG诱导后预期的条带显著增强(图2A)。为进一步确认外源质粒编码蛋白的表达，我们利用抗His标签的单克隆抗体进行了Western blotting检测，从而确定了HLA C端His标签融合蛋白的表达，特别是在IPTG诱导之后(图2B)。结果同时还显示大量表达的HLA融合蛋白定位于不溶性的包涵体，因而在纯化前需要经过变性-复性的过程。通过体外复性，可得到高丰度天然折叠(native fold)的重组蛋白。蛋白复性后经过镍离子亲和层析，我们从原核表达菌裂解产物中获得高纯度的重组HLA(图2C)。

图2 重组HLA(rHLA)的分离和纯化Fig.2 Isolation and purification of recombinant HLA

2.3 rHAMLET的制备和生化特征分析

通过对 HLA，apo-HLA和 BLA(PDB accession 1a4v，1f6s和1b9o)蛋白结构进行比较(图3A)，发现HLA和BLA空间结构相似，因此我们选择BLA作为HAMLET制备和结构鉴定的阳性对照样品。在rHAMLET制备过程中，通过对37℃加热1 h处理后的rHAMLET及其各组对照样品进行蛋白电泳分析，我们发现rHLA，rHAMLET和apo-rHLA的蛋白组分无明显降解，除了单体蛋白(14～17 000)以外，与BAMLET相比，在25～30 000处可见更多的二聚体形成(图3B)。此结果表明我们制备HAMLET的方法具备较好的质量，并且提示可以通过自身的聚合现象介导针对细胞的活性功能。

通过对rHAMLET在250～300 nm下光谱曲线的变化分析，我们发现在0.9%NaCl中经37℃孵育1 h后的rHAMLET和BAMLET有相似光谱特征，并且与单纯的OA和复性后的rHLA存在显著不同(图3C)。通过进一步的ANS结合实验发现，rHAMLET和BAMLET的ANS结合活性显著增加，使ANS最大发射波长迁移至450 nm(图3D)，而OA和rHLA则无此现象。结果显示rHAMLET、BAMLET与rHLA相比结构更为松散，可暴露出更多的疏水区域与OA结合并且与ANS作用，从而进一步表明了我们所制备的rHAMLET具有与BAMLET相似的结构基础，并参与发挥类似的生物学活性。

图3 重组HAMLET(rHAMLET)结构及生化性质与BAMLET的比较Fig.3 Biochemical analyses of rHAMLET in comparison with BAMLET produced by the classical method

2.4 rHAMLET对肿瘤细胞的杀伤活性检测

HeLa细胞经rHAMLET作用6 h后，通过MTS实验检测rHAMLET对肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示rHAMLET和BAMLET作用的HeLa细胞的存活率(10～25%)显著低于高浓度的HLA，BLA以及OA处理组(80～90%)(图4A)，同时，rHAMLET对HeLa细胞的杀伤作用呈现出与BAMLET处理组相似的剂量依赖性(图4B)，表明我们用重组HLA制备的rHAMLET与用BLA纯品制备的BAMLET同样具有较强的肿瘤杀伤活性。

对rHAMLET和BAMLET处理后的HeLa细胞分别进行形态学观察，可见显著的细胞病变表现，胞体变圆、体积缩小、贴壁能力下降;同时由于部分细胞死亡，与HLA、BLA以及OA对照组相比细胞数显著减少。在rHAMLET和 BAMLET处理后，HeLa细胞经DAPI复染的细胞核与对照组相比，出现细胞核皱缩、形态变小、致密度增强、且部分细胞核出现碎裂等，提示细胞凋亡作用可能在很大程度上参与了rHAMLET和BAMLET的杀伤效应(图4C)。

图4 rHAMLET对HeLa细胞的杀伤活性与BAMLET相似Fig.4 rHAMLET induced cell death in HeLa cells

2.5 rHAMLET可引起肿瘤细胞的凋亡

我们采用TUNEL染色法检测了rHAMLET和BAMLET处理后细胞的凋亡指标改变。TUNEL染色法在DNA的双链断裂产生缺口而出现的3'-OH末端，经脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)催化，将其末端标记上绿色荧光衍生物。实验过程中我们同时以PI的红色荧光复染视野中的全部细胞核，因而可以通过绿色与红色荧光的比例判断细胞出现凋亡的程度。结果如图5所示，HeLa细胞经rHAMLET和BAMLET作用6 h后，绿色荧光阳性的细胞显著增多，且与红色荧光的比例增加;同时，rHAMLET高浓度组比低浓度组相比，上述现象更加明显，表明rHAMLET和BAMLET都可以引起HeLa细胞的凋亡，细胞的凋亡随着rHAMLET浓度的升高而增多。

3 讨论

HAMLET作为一种体外形成的蛋白/脂类复合物，却可以选择性的杀伤肿瘤细胞，其作用机制一直受到人们的关注。在恶性胶质瘤细胞中，HAMLET可以吸附肿瘤细胞，迅速进入细胞核内并聚集，而在成熟的正常细胞中，HAMLET只有少量在细胞质中存在，主要在细胞膜上［4］。HAMLET在细胞内的聚集可导致线粒体膜通透性增强等细胞内的变化，引起细胞的凋亡［10-11］，但是也有报道［12］显示细胞的死亡并未激活经典的凋亡途径。近来研究［13-14］发现原癌基因c-Myc和黏附分子 α-Actinin等［14］可以作为 HAMLET作用肿瘤细胞的靶点，为揭示HAMLET选择性杀伤肿瘤细胞的机制提供了线索。

图5 rHAMLET通过激活细胞凋亡诱导HeLa的细胞死亡Fig.5 Cell death of HeLa cells induced by rHAMLET treatments involved the activation of apoptosis as determined by TUNEL assays

HLA(人α乳清蛋白，相对分子质量142 000)为123氨基酸组成的酸性钙结合蛋白，主要有2个结构域:包括一个α-螺旋结构域包含4个α-螺旋(氨基酸残基5-11，23-34，86-98和106-110)和一个由3个β-折叠组成的结构域(41-43，48-50和55-56)(图1A)。HLA的C端游离，未参与其功能结构的形成和稳定。因此，在C末端引入His标签，如本研究所证实，没有影响HLA的结构复性以及形成活性rHAMLET的能力。

HLA肽链在乳腺细胞的内质网中折叠(folded)生成具有三级结构的蛋白。原核表达细胞中的人，牛等［15-16］种属的α乳清蛋白因折叠异常而主要存在于包涵体中，与本研究HLA-His融合蛋白表达的情况表现一致。HLA球形蛋白结构的稳定主要依赖于钙离子结合环(K79，D82，D84，D87和D88)和4个分子内二硫键(6-12，61-77，73-91 和28-111)［17-18］，只有失去Ca2+后转变成熔球态结构的apo-HLA，才具有结合油酸并形成HAMLET的能力［15］。所幸的是，HLA可在合适的含Ca2+电解质中完成体外复性并恢复其天然结构，使得本研究中的rHLA依然能够用于HAMLET的制备，并表现出与天然蛋白相仿的细胞杀伤活力［8］。

我们的实验结果显示融合His标签的HLA能够在37℃条件下部分形成二聚体，多聚体形式的HLA，称为 MAL(multimers of α-lactalbumin)，被认为很可能是HAMLET的活性组成，引起肿瘤细胞的凋亡［19］。OA的存在使rHAMLET暴露更多疏水结构，与Atri等［20］报道的LA-OA-60复合物结构变化相似，本研究中紫外光谱分析和ANS结合实验结果表明rHAMLET和BAMLET比rHLA形成更多的稳定二聚体。因此，虽然由rHLA和油酸所制备的rHAMLET复合物具有与经典的BAMLET相似的肿瘤杀伤活性［12］，可以引起HeLa细胞的凋亡样的死亡，但在其细胞内代谢、生物学效应和作用机制等方面可能存在些微的不同。

HAMLET作为肿瘤细胞的选择性杀伤制剂逐渐引起越来越多的兴趣和重视，改善其制备策略和方法成为近年来相关研究的重点之一［21］。本研究所完成的通过融合His标签HLA制备HAMLET的方法，有效地解决了HLA在天然原料中丰度较低，高纯度纯化步骤复杂和困难等问题;同时与传统的离子交换层析方法相比更为简单，且生产成本更加经济。所得到的纯化rHLA，可以规模化用于apo-HLA的制备，并且非常适合在OA混合加热法［22-23］，这一迄今为止最为简便的HAMLET生产方法中应用。本研究所提供的rHAMLET制备方法和产品，为HAMLET的规模化生产提供了可靠的依据，为HAMLET在更多、更广泛的使用，包括在大型动物模型中的应用等，奠定了重要的基础。与此同时，rHAMLET还可以帮助对HAMLET及其类似物的作用机制研究，如可通过anti-His抗体pull-down和后续的蛋白相互作用实验研究其在肿瘤细胞中的作用靶点等。因此，本研究在HAMLET功能机制探讨和在肿瘤临床前期应用中均有可观的潜在价值。

［1］Hakansson A，Zhivotovsky B，Orrenius S，et al.Apoptosis induced by a human milk protein［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(17):8064-8068.

［2］Gustafsson L，Hallgren O，Mossberg A K，et al.HAMLET kills tumor cells by apoptosis:structure，cellular mechanisms，and therapy［J］.J Nutr，2005，135(5):1299-1303.

［3］Hallgren O，Aits S，Brest P，et al.Apoptosis and tumor cell death in response to HAMLET(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells)［J］.Adv Exp Med Biol，2008，606:217-240.

［4］Fischer W，Gustafsson L，Mossberg A K，et al.Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells(HAMLET)kills human glioblastoma cells in brain xenografts by an apoptosis-like mechanism and prolongs survival［J］.Cancer Res，2004，64(6):2105-2112.

［5］Gustafsson L，Leijonhufvud I，Aronsson A，et al.Treatment of skin papillomas with topical alpha-lactalbumin-oleic acid［J］.N Engl J Med，2004，350(26):2663-2672.

［6］Mossberg A K，Wullt B，Gustafsson L，et al.Bladder cancers respond to intravesical instillation of HAMLET(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells)［J］.Int J Cancer，2007，121(6):1352-1359.

［7］Mok K H，Pettersson J，Orrenius S，Svanborg C.HAMLET，protein folding，and tumor cell death［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，354(1):1-7.

［8］Svensson M，Hakansson A，Mossberg A K，et al.Conversion of alpha-lactalbumin to a protein inducing apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(8):4221-4226.

［9］Svensson M，Fast J，Mossberg A K，et al.Alpha-lactalbumin unfolding is not sufficient to cause apoptosis，but is required for the conversion to HAMLET(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells)［J］.Protein Sci，2003，12(12):2794-2804.

［10］Kohler C，Gogvadze V，Hakansson A，et al.A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria［J］.Eur J Biochem，2001，268(1):186-191.

［11］Zhang M，Yang F，Jr.，Yang F，et al.Cytotoxic aggregates of alpha-lactalbumin induced by unsaturated fatty acid induce apoptosis in tumor cells［J］.Chem Biol Interact，2009，180(2):131-142.

［12］Hallgren O，Gustafsson L，Irjala H，et al.HAMLET triggers apoptosis but tumor cell death is independent of caspases，Bcl-2 and p53［J］.Apoptosis，2006，11(2):221-233.

［13］Storm P，Aits S，Puthia M K，et al.Conserved features of cancer cells define their sensitivity to HAMLET-induced death;c-Myc and glycolysis［J］.Oncogene，2011，30(48):4765-4779.

［14］Trulsson M，Yu H，Gisselsson L，et al.HAMLET binding to alpha-actinin facilitates tumor cell detachment［J］.PLoS One，2011，6(3):e17179.

［15］Pettersson-Kastberg J，Mossberg A K，Trulsson M，et al.alpha-Lactalbumin，engineered to be nonnative and inactive，kills tumor cells when in complex with oleic acid:a new biological function resulting from partial unfolding［J］.J Mol Biol，2009，394(5):994-1010.

［16］Ishikawa N，Chiba T，Chen L T，et al.Remarkable destabilization of recombinant alpha-lactalbumin by an extraneous N-terminal methionyl residue［J］.Protein Eng，1998，11(5):333-335.

［17］Iyer L K，Qasba P K.Molecular dynamics simulation of alpha-lactalbumin and calcium binding c-type lysozyme［J］.Protein Eng，1999，12(2):129-139.

［18］Pettersson J，Mossberg A K，Svanborg C.alpha-Lactalbumin species variation，HAMLET formation，and tumor cell death［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345(1):260-270.

［19］Hakansson A，Andreasson J，Zhivotovsky B，et al.Multimeric alpha-lactalbumin from human milk induces apoptosis through a direct effect on cell nuclei［J］.Exp Cell Res，1999，246(2):451-460.

［20］Atri M S，Saboury A A，Moosavi-Movahedi A A，et al.Structure and stability analysis of cytotoxic complex of camel alpha-lactalbumin and unsaturated fatty acids produced at high temperature［J］.J Biomol Struct Dyn，2011，28(6):919-928.

［21］Zhang Y B，Wu W，Ding W.From HAMLET to XAMLET:The molecular complex selectively induces cancer cell death［J］.Afri J Biotech 2010，9(54):9270-9276.

［22］Knyazeva E L，Grishchenko V M，Fadeev R S，et al.Who is Mr.HAMLET?Interaction of human alpha-lactalbumin with monomeric oleic acid［J］.Biochemistry，2008，47(49):13127-13137.

［23］Tolin S，De Franceschi G，Spolaore B，et al.The oleic acid complexes of proteolytic fragments of alpha-lactalbumin display apoptotic activity［J］.Febs J，2010，277(1):163-173.