HIV-1 Nef重组重叠肽诱导小鼠免疫保护作用研究

张宏伟 张 彤 夏 炜 吴 昊

(首都医科大学附属北京佑安医院感染科，北京100069)

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的以 CD+4T淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种综合性免疫缺陷疾病。自1981年首次报道［1］以来，经过30多年的医学研究，已研发出30余种抗HIV药物，通过使用这些药物联合抗病毒治疗，使艾滋病发生率和病死率显著降低，从而使艾滋病从一种被早期医学宣判为死刑的疾病转为一种可治疗和可控制的慢性疾病［2-3］。然而，现有的抗病毒治疗仍存在局限性，一方面无法清除体内的病毒，需要终身治疗，给患者和社会带来沉重的经济负担;另一方面长期抗病毒治疗可能会产生潜在的不良反应以及耐药，从而导致治疗失败［4-5］。

纵观人类与疾病斗争的历史，无数事实都证明，唯有疫苗才是控制传染病最有力和最经济的武器。从20世纪80年代后期开始，国际医学界把艾滋病疫苗的研制提到了与开发治疗药物同等重要的位置。但时至今日，整个研究领域仍然没有明确的方向［6］。传统的灭活疫苗无法抵御HIV感染，而减毒活病毒疫苗的安全性是一个值得考虑的问题。DNA疫苗在人体的免疫原性较低，表位肽疫苗仅限于HLA表型相配的个体，疫苗产生的免疫应答谱较窄，而且鉴定表位和HLA分型也是一项费时而又费力的过程［7］。

我们采用重组重叠肽策略克服HLA限制性有关问题，并与相应蛋白进行比较，免疫接种2个种系的小鼠，采用ELISPOT和ICS方法检测特异性细胞免疫应答，采用高剂量痘苗病毒攻击试验检测疫苗对小鼠的保护性。

1 材料和方法

1.1 材料

表达重叠肽的pET16b质粒由牛津大学分子医学研究所姜石松博士提供，重叠肽覆盖HIV-1 Lai Nef全长(202氨基酸)，共计20个肽段(分别以P1～P20表示)，每个肽段长度为20个氨基酸(第20个肽段长度为12个氨基酸)，相邻肽段之间重叠10个氨基酸，肽段之间以凝血第10因子裂解位点连接，重组重叠肽(recombinant overlapping peptide，ROPp)及其相应蛋白(以ROP表示)的表达和纯化参见相关文献［8］。胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和RPMI1640培养液购自美国 Gibico公司，IFN-(ELISPOT试剂盒购自瑞典Mabtech公司，FITCIFN-γ/PE-CD8/PerCP-CD4购自英国 BioInsight公司。6～8周龄雌性BLAB/c和C57BL/10小鼠购自牛津大学动物所。

1.2 免疫小鼠

C57BL/10或BALB/c小鼠首次免疫给予200 μg Nef ROPp或ROP混悬于100 μL弗氏完全佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)皮下注射。对照组小鼠单独给予100 μL CFA。每隔3周给予1次加强免疫，共进行2次加强免疫。加强免疫的疫苗与首次免疫相同，但均混悬于100 μL弗氏不完全佐剂中。第2次加强免疫后3周，采集脾脏进行IFN-γ ELISPOT试验和胞内细胞染色(每组5只小鼠)，或进行病毒攻击试验(每组10只小鼠)。

1.3 ELISPOT试验

小鼠处死后，分离脾脏，以钢网研磨法制备脾细胞悬液，以密度梯度离心法制备脾单个核细胞(spleen mononuclear cell，SMC)，将细胞浓度调至5×106/mL备用。

ELISPOT参照Mabtech公司的操作说明书，在96孔板每孔中加入100 μL用无菌磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)以1/1 000比例稀释的包被抗体，置于4℃冰箱过夜。在使用前将该板用180 μL无菌PBS洗4遍。每孔加入100 μL 10%FCS/RPMI1640，于37℃放置1 h。在实验组孔中加入100 μL细胞及100 μL肽段，浓度分别为5×106/mL和10 μmol/L;阳性对照孔中加入终浓度为0.5 ng/L的刀豆蛋白A，阴性对照加入100 μL 10%FCS/RPMI1640。将板置于37℃、5%CO2孵育箱中孵育16～18 h。取出96孔板后，甩去细胞及培养液，每孔加入200 μL冰水，在4℃放置5 min，以200 μL PBS洗6遍。每次更换洗液时用排枪吹打孔底，以便冲洗干净。每孔加入100 μL按1/1 000稀释在PBS中的检测抗体，置于室温孵育2 h。以200 μL PBS洗6遍后，加入100 μL按1/1 000比例稀释在PBS中的抗生物素碱性磷酸酶结合物，置于室温孵育1 h。再以200 μL PBS洗6遍。每孔加入100 μL底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐/四唑氮蓝，室温反应20～30 min。自来水冲洗，洁净台风口处吹干，避光保存，次日读板。采用AID ELISPOT进行读板并计数斑点和统计结果。ELISPOT的阳性判断标准为:细胞斑点数≥10 SFU/106细胞，且高于阴性对照2倍。

1.4 胞内细胞染色

在96孔板中每孔加入100 μL SMC细胞悬液以及相应刺激原如10 μmol/L合成的重叠肽第8号肽段(P8)或阳性对照刀豆蛋白A，37℃孵育6 h，在孵育1.5～2 h内加入布雷菲德菌素A。

每孔以200 μL 5%FCS/PBS洗涤细胞2次，以5%FCS/PBS 1:200稀释CD16/CD32，每孔中加入30 μL稀释液，混匀后置于室温避光孵育10 min或置于4℃避光孵育20 min，以阻断非特异性CD4结合位点。洗涤2次，以5%FCS/PBS缓冲液1:100稀释荧光抗体，每孔中加入30 μL稀释的单克隆荧光抗体 PECD8/PerCP-CD4;阴性对照以加入 PE-(/PE-CY5-(。混匀后置于4℃避光孵育20 min。洗涤2次后每孔加入100 μL Cytofix/Cytoperm固定和穿孔液，混匀后置于4℃避光孵育20 min，再洗涤2次后以FACS缓冲液1:100稀释荧光抗体FITC-IFN-γ，阴性对照以加入FITC-(，混匀后置于4℃避光孵育20 min。洗涤后，每孔中加入250 μL细胞固定液，混匀后上机检测。

1.5 痘苗病毒攻毒保护试验

由于HIV-1不能感染小鼠，因此，采用可以感染小鼠且含有HIV-1 Nef基因的痘苗病毒进行攻毒试验。在末次免疫小鼠3周时，腹腔注射痘苗病毒，剂量为3×108PFU，连续8 d观察小鼠的存活情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料用n(%)表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗原特异性细胞免疫应答

对于佐剂组、ROP组和ROPp组免疫的C57BL/10小鼠，在特异性细胞免疫应答宽度方面，佐剂组对于LAI Nef中的所有肽段均为阴性，ROP组对于LAI Nef中的P1、P2、P5、P7、P8、P15 和 P20 细胞免疫应答为阳性，而ROPp组对于LAI Nef所有20个肽段的特异性细胞免疫应答均为阳性;在反应强度方面，ROP组为(24.2±10.2)SFU/106SMC，ROPp组为(145.7±36.2)SFU/106SMC，ROPp组显著高于ROP组(t=-7.229，P=0.001)。

在BALB/c小鼠中，我们也比较了ROP和ROPp之间的细胞免疫应答效果。在免疫应答宽度方面，ROP组对P9、P11、P13和P18细胞免疫应答为阳性，ROPp组除此之外，还对P1、P2、P5、P6、P19和P20细胞免疫应答为阳性。在细胞免疫应答强度方面，ROP组为(19.8±9.0)SFU/106SMC，ROPp组为(148.8±50.4)SFU/106SMC。ROPp组显著高于ROP组(t=-5.635，P=0.004)。

2.2 特异性细胞免疫应答的交叉反应

对于HIV-1 LAI Nef免疫的小鼠，我们采用HIV-1 NL4-3病毒株的Nef进行Elispot试验，检测免疫接种诱导的交叉反应，研究结果显示，在LAI Nef免疫的C57BL/10小鼠中，ROP组为(20.7±9.5)SFU/106SMC，ROPp组为(104.0 ±33.8)SFU/106SMC。ROPp组显著高于ROP组(t=-5.297，P=0.004)。

表1 HIV Nef重组重叠肽与相应蛋白细胞免疫强度比较Tab.1 Comparison of cellular immune intensity of HIV Nef recombinant/overlapping peptide and corresponding protein (n=5，±s)

表1 HIV Nef重组重叠肽与相应蛋白细胞免疫强度比较Tab.1 Comparison of cellular immune intensity of HIV Nef recombinant/overlapping peptide and corresponding protein (n=5，±s)

Investigated in mice ROP ROPp t/P C57BL/10 24.2±10.2 145.7±36.2 -7.229/0.001 BALB/c 19.8±9.0 148.8±50.4 -5.635/0.004 LAI Nef immunogenic C57BL/10 20.7±9.5 104.0±33.8 -5.297/0.004

2.3 特异性细胞免疫应答的亚群类型

在Elispot试验中我们观察到ROPp免疫的小鼠对于P8的特异性细胞免疫应答较强，为了进一步观察这些特异性细胞的亚群类型，我们在体外以P8刺激免疫的小鼠脾细胞，采用胞内细胞染色的方法检测特异性细胞应答的比例和类型。结果显示，分泌INF-γ特异性CD4细胞的百分比在ROP组和ROPp组分别为0.63和1.53，2组之间差异有统计学意义(t=5.380，P=0.001)。分泌INF-γ特异性CD8细胞的百分比在ROP组和ROPp组分别为0.26和0.80，2组之间差异有统计学意义(t=3.754，P=0.006)。在ROPp组，与特异性CD8细胞(0.80)相比，特异性CD4细胞(1.53)所占的比例较高(t=3.741，P=0.006)。

2.4 痘苗病毒攻毒保护试验结果

病毒攻击后，10只未免疫的小鼠于第1天6例出现死亡，第2天全部死亡;单纯佐剂组在第1天5只出现死亡，第2天3只出现死亡，观察至第8天未再出现死亡;ROP组在第2天2只出现死亡，第5天4只出现死亡，观察至第8天未再出现死亡;ROPp组在第1天2只出现死亡，观察至第8天未再出现死亡。重叠肽组小鼠的存活率80%(8/10)显著高于佐剂组20%(2/10)，Fisher精确检验，检验值为6.840，P=0.023。

3 讨论

重叠肽疫苗是一种全新的疫苗设计理念，它克服了表位肽疫苗HLA限制相关问题，无需了解接种人群遗传背景，在应用上具有表位肽无可比拟的优势。但在免疫接种效果上，尚未见报道。本研究采用HIV-1 Nef为例证，探讨了重组重叠肽疫苗在细胞免疫应答和免疫保护方面的效果。

Nef作为HIV附属蛋白之一，相对分子质量较小，具有一些保守模体，这是我们选择Nef的主要依据。以往关于疫苗的研究中，也有许多以Nef为靶向的报道［9-11］。齐香荣等［11］的研究以含有 Nef的疫苗为例，探讨了复制型和非复制型疫苗的联合使用效果。而周东霞等［9］研究则以 Nef为例探讨了 HIV DNA疫苗的免疫效果，其研究结果显示，重组质粒pVAX-nef免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应，但诱导的CTL表位不够理想。

我们的结果显示，采用重组重叠肽免疫小鼠后，在不同株系的小鼠中均可诱导较强的细胞免疫应答，说明重组重叠肽具有较强的免疫原性，且与相应的蛋白相比更胜一筹。由于我们没有采用DNA疫苗进行对比，而且不同的试验的条件不同，所以无法判断重组重叠肽疫苗与DNA疫苗之间何者的免疫原性更高。采用不同株系的病毒进行检测，我们发现，重组重叠肽免疫的小鼠可产生交叉性特异性细胞免疫应答。这可能与Nef序列的保守性有关。

在抗病毒免疫应答中，CD+8T细胞主要发挥免疫杀伤作用［12］，而CD4辅助细胞对于整个免疫应答的调节，包括效应性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和B细胞的产生具有十分重要的作用［13-14］。测定免疫接种后免疫应答的细胞类型对于探讨免疫应答的机制具有十分重要的作用。本文的结果显示，在重组重叠肽诱导的特异性免疫应答中，以CD4细胞为主，而CD8细胞也占有一定的比例，这种特点对于特异性细胞免疫和体液免疫的产生和调控可能有益。

研制疫苗的最终目的是产生切实的保护作用。在艾滋病的疫苗研制中，一个最为棘手的问题是攻毒保护试验［15］，因为HIV具有种属特异性，HIV不能感染小鼠，我们采用含有Nef基因的痘苗病毒进行攻毒保护试验。研究结果显示，与佐剂组和重叠肽蛋白组相比，重组重叠肽疫苗具有显著的保护作用。尽管这一结果并不能说明该种疫苗能够保护人类抵御HIV感染，但对于了解重叠肽疫苗的实际效果具有十分重要的意义，对于其他病毒疫苗的研制也具有一定的指导意义。

综上所述，重组重叠肽疫苗克服了多肽疫苗中HLA限制的相关问题，在小鼠模型中可产生较强的广谱的特异性细胞免疫应答，对于不同病毒株系的Nef具有交叉反应。重组重叠肽疫苗产生的免疫应答强度显著高于相应蛋白组。更为可贵的是，这种疫苗具有保护作用。重组重叠肽疫苗在艾滋病领域值得进一步深入研究。

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