冠状动脉微栓塞后Toll样受体4的变化

常书福 马剑英 钱菊英 陈章炜 姚瑞明 葛均波

（复旦大学附属中山医院心内科，上海市心血管病研究所，上海 200032）

冠状动脉斑块破裂或血栓脱落等引起的冠状动脉微栓塞（coronary microembolization，CME）可导致心肌缺血、坏死，引起重度心律失常、心室收缩功能障碍［1］。本研究采用冠状动脉介入方法建立的猪CME模型，探讨CME后Toll样受体4（Toll－like receptor 4，TLR4）的变化情况。

1 资料与方法

1.1 实验动物 12周龄的健康小型家猪12头，体质量21～25 kg，实验组和对照组各6头。

1.2 微栓塞球制备 取直径42μm的微栓塞球10～15μL（Dyno公司，挪威），放入1.5 mL离心管中，管中再加入1 mL弱0.9%氯化钠液，显微镜下计数；然后取15万个微球放入60 mL离心管中，加入0.9%氯化钠液配成40～45 mL悬液。每次使用前剧烈震荡5s，将悬液抽入60 mL注射器内，然后用5 mL0.9%氯化钠液冲洗2次。

1.3 动物模型建立 肌内注射氯胺酮（5 mg／kg），以地西泮（10 mg／kg）和阿托品（0.08 mg／kg）诱导麻醉后，用3%戊巴比妥维持麻醉。建立耳静脉通道，滴注0.9%氯化钠液。分离右侧股动脉，置入7F动脉鞘，经鞘管首剂给予肝素200 U／kg，此后每1 h静脉注射肝素100 U／kg，维持肝素化。

用数字减影血管造影仪行冠状动脉造影，送入7F EBU3.5指引导管至左冠状动脉口，确定前降支位置及分布。送入微导管（3.0／2.8F）至前降支中段，经微导管将微栓塞球悬液注入前降支内，再用10 mL0.9%氯化钠液冲洗微导管并注入冠状动脉内，制成CME动脉模型（研究组）。对照组则在其前降支注入等量的0.9%氯化钠液。然后两组再次行冠状动脉造影。

1.4 样本采集和分析

1.4.1 样本采集 1周后静脉注射30%氯化钾30 mL，处死CME模型猪，取出心脏，平行于房室沟切块，前壁、后壁各取5块质量为50～100 mg的心肌组织，液氮冷冻后移入－70℃冰箱，用于RNA及蛋白分析。

1.4.2 蛋白质印迹（Western－blot） 取50～100 mg心肌组织，提取蛋白并用二可辛酸（bicinchonininc acid，BCA）法定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。TLR4抗体购自Santa Cruz公司。

1.4.3 实时聚合酶链反应（real－time polymerase chain reaction） 取50～100 mg心肌组织，提取其RNA后进行逆转录；外源性TLR4、内参GAPDH均由上海生工公司合成，TLR4引物序列正义链及反义链分别为5′－CTCTGCCTTCACTACAGAGA－3′和5′－CTGAGTCGTCTCCAGAAGAT－3′，GAPDH引物序列正义链、反义链分别为5′－TCATCAGCAATGCCTCCTGTACCA－3′和 5′－TATTTGGCAGGTTTCTCCAGACGG－3′。 扩 增 方 案：94℃加热5 min；然后94℃加热30 s、55℃加热30 s、72℃加热30 s，循环进行40次；72℃延伸10 min。

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。2组之间比较采用两独立样本的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌组织TLR4蛋白水平 猪心肌组织TLR4蛋白水平见图1。CME1周后实验组心肌组织前壁TLR4蛋白水平显著高于后壁（P＜0.05）。而对照组前壁、后壁TLR4蛋白水平和CME组后壁相比，差异无统计学意义，见表1。

图1 猪心肌组织中TLR4蛋白水平

2.2 心肌组织TLR4 mRNA水平 猪心肌组织TLR4 mRNA水平见表1。CME1周后实验组心肌组织前壁TLR4 mRNA水平显著高于后壁（P＜0.05）；而对照组前壁、后壁TLR4 mRNA水平与CME组后壁相比，差异无统计学意义。

表1 猪心肌组织中TLR4蛋白水平

3 讨 论

CME后会引发局灶性心肌微梗死和一过性心肌收缩功能障碍，但1周左右可恢复［2－3］。由于冠状动脉微血管网丰富，多处心肌坏死可引起局部心肌收缩功能障碍，但这并不是导致心肌收缩功能减弱的主要原因［2］。目前认为，炎性反应是CME后心功能变化的主要发生机制［4］。

TLRs家族在病原体的识别和激活天然免疫方面发挥着非常重要的作用。激活的TLRs不仅可以诱导天然免疫应答，而且有利于特异性免疫反应发生。TLR4在体内分布广泛，分布于心肌中的TLR4与心血管疾病关系密切［5］。心力衰竭的病理机制复杂，炎性反应也参与了这一过程。在心力衰竭的动物模型和患者中，TLRs被激活，且其分布形态发生了变化。在正常大鼠和人心肌中，TLR4弥散分布，主要分布在心肌内；而在心力衰竭患者中，TLR4呈局灶性聚集分布［6］。

本研究发现，心肌TLR4表达在CME1周后显著升高，而后壁与对照组前后壁无显著差异，提示TLR4可能参与了CME后的炎性反应。

［1］ Stenberg TA，Steigen T，Myrmel T.Microvascular occlusions and coronary microembolization［J］.Scand Cardiovasc J，2011，45（5）：258－260.

［2］ Dorge H，Schulz R，Belosjorow S，et al.Coronary microembolization：the role of TNF－αin contractile dysfunction［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34（1）：51－62.

［3］ Ma J，Qian J，Ge J，et al.Changes in left ventricular ejection fraction and coronary flow reserve after coronary microembolization［J］.Arch Med Sci，2012，8（1）：63－69.

［4］ Heusch G，Kleinbongard P，Bose D，et al.Coronary microembolization from bedside to bench and back to bedside［J］.Circulation，2009，120（18）：1822－1836.

［5］ Lee CC，Avalos AM，Ploegh HL.Accessory molecules for Toll－like receptors and their function［J］.Nat Rev Immunol，2012，12（3）：168－179.

［6］ Frantz S，Kobzik L，Kim YD，et al.Toll4（TLR4）expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium［J］.J Clin Invest，1999，104（3）：271－280.