雷帕霉素和紫杉醇对骨髓内皮祖细胞数量及功能的影响

朱琳琳 陈绍良 张娟 刘志忠

（南京医科大学附属南京第一医院心内科，江苏 南京 210006）

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管内皮的前体细胞，存在于成年机体的骨髓及外周血中，在成体血管新生中起重要作用。雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，具有抗真菌、免疫抑制以及抗肿瘤作用。紫杉醇是一种抗增殖药物，具有抗肿瘤作用。在冠状动脉介入治疗术中应用雷帕霉素或紫杉醇药物洗脱支架，可显著降低支架内再狭窄的发生率。本研究旨在探讨雷帕霉素和紫杉醇对体外培养的大鼠骨髓来源的EPCs的数量及其增殖能力、迁移能力和黏附能力的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 体质量为100 g左右的雄性SD（Sprague Dawley）大鼠10只，由南京医科大学动物实验中心提供。异硫氰酸荧光素标记的单叶豆凝集素1（FITC－BS－1 lectin）、雷帕霉素和紫杉醇购自SIGMA公司；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI－acLDL）购自 Molecular Probes公司。细胞培养液为DMEM（购自GIBCO公司），含10%胎牛血清（购自Hyclone公司）。

1.2 EPCs的分离和培养 将SD大鼠断颈处死，置于70%乙醇中20～30 min，无菌条件下分离大鼠的股骨和胫骨，去除附着于骨的软组织和骨骺端。将分离的股骨和胫骨移入无菌平皿，用5 mL磷酸缓冲液（PBS）将骨髓冲出，用200目滤网过滤骨髓并以2000 r／min离心5 min。将沉淀细胞重悬于10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液中，以2×106／孔接种于明胶包被的24孔培养板上，置于细胞培养箱中培养。接种后4 d用PBS冲洗去掉未贴壁细胞，更换培养液培养至7 d，再次用PBS冲洗去掉未贴壁细胞，得到贴壁细胞供后续实验用。

1.3 细胞染色及鉴定 将贴壁细胞随机分为7组：A 组：雷 帕 霉 素 5.0μg／mL；B 组：雷 帕 霉 素1.0μg／mL；C组：雷帕霉素0.1μg／mL；D组：紫杉醇5.0μg／mL；E组：紫杉醇1.0μg／mL；F组：紫杉醇0.1μg／mL；G组：对照组，加入溶剂二甲基亚砜（DMSO）。各组细胞在含相应浓度药物的10%胎牛血清的DMEM培养液中培养24 h。对贴壁细胞进行 DiI－acLDL和 FITC－BS－1 Lectin双标记，将染色双阳性者认定为EPCs。具体方法：细胞与DiI－acLDL（2.4μg／mL）在37℃下孵育1 h，观察EPCs对DiI－acLDL的摄取。然后以2%多聚甲醛固定细胞10 min，固定后用PBS浸洗，将FITC－BS－1 Lectin（10μg／mL）加于上述标本中，在37℃下孵育1 h后用激光共聚焦显微镜鉴定，双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。采用倒置荧光显微镜进行计数（计数10个随机选择的×200视野的EPCs）。

1.4 EPCs黏附能力的检测 用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，将其悬浮于500μL培养液中，计数。每组以相同数目EPCs接种在明胶包被的培养板上，37℃下培养30 min后，计数贴壁细胞。

1.5 EPCs迁移能力的检测 采用改良的Boyden小室法分析。用0.25%胰蛋白酶消化，搜集贴壁细胞，将其悬浮于500μL培养液中，计数。每组将相同数目的EPCs悬浮于50μL培养液注入上室，下室分别加入DMSO、不同浓度的雷帕霉素和紫杉醇以及25μL培养液，37℃下培养24 h，小心刮去滤膜上层的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择3个显微镜视野（×200），计数迁移至下层的细胞。

1.6 EPCs增殖能力的检测 将等量的EPCs接种于明胶包被的96孔培养板上，每孔加入10μL MTT（5 g／L），培养4 h后，去除上清液，再加入DMSO（150μL／孔），用微振荡器振荡10 min，用酶标仪于波长490 nm处测OD值。

1.7 统计学处理 采用SPSS16.0软件包进行分析。数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析与两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EPC的鉴定 将大鼠骨髓中分离获得的细胞培养7 d后，形成了梭形的内皮样细胞。用DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin对细胞染色后，通过激光共聚焦显微镜鉴定，DiI－ac LDL和FITC－BS－1 Lectin双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs，并在倒置荧光显微镜200倍下计数10个随机选择的视野中的EPCs。

2.2 不同浓度雷帕霉素和紫杉醇对EPCs数量的影响 雷帕霉素及紫杉醇各组与对照组相比，EPCs数量均较少，差异有统计学意义（P＜0.01）。随着雷帕霉素、紫杉醇浓度的增加，EPCs的数量逐渐减少（P＜0.05）。相同浓度的雷帕霉素和紫杉醇对EPCs的数量的影响无显著差异（图1和表1）。

图1 各组在激光共聚焦显微镜下的正在分化的EPCs（×200）

2.3 不同浓度雷帕霉素和紫杉醇对EPCs黏附能力的影响 雷帕霉素和紫杉醇各组与对照组相比，EPCs的黏附能力低。随着雷帕霉素、紫杉醇浓度的增加，EPCs的黏附能力逐渐降低。相同浓度的雷帕霉素和紫杉醇对EPCs黏附能力无显著影响，见表1。

2.4 不同浓度雷帕霉素和紫杉醇对EPCs迁移能力的影响 雷帕霉素及紫杉醇各组与对照组相比，EPCs迁移能力降低。随着雷帕霉素、紫杉醇浓度的增加，EPCs的迁移能力逐渐降低。相同浓度的雷帕霉素和紫杉醇对EPCs迁移能力无显著影响，见表1。

2.5 不同浓度雷帕霉素和紫杉醇对EPCs增殖能力的影响 雷帕霉素及紫杉醇各浓度组与对照组相比，EPCs增殖能力降低。随着雷帕霉素、紫杉醇浓度的增加，EPCs的增殖能力逐渐降低。相同浓度的雷帕霉素和紫杉醇对EPCs增殖无显著影响，见表1。

表1 不同浓度雷帕霉素和紫杉醇对EPCs数量与功能的影响

3 讨 论

血管内皮损伤是冠状动脉斑块形成中的关键起始步骤，因此内皮损伤后的完全修复非常重要。内皮修复可以借助损伤周围成熟内皮细胞的迁移及增殖完成，但成熟内皮细胞是已分化细胞，其增殖能力有限。EPCs具有分化为成熟内皮细胞的能力，动物实验及临床研究表明［1－2］，新生血管中25%的内皮细胞是由EPCs分化而来。EPCs在外伤愈合［3］、心肌梗死后修复［4］及移植血管内皮化［5］等过程中起促进作用。在球囊损伤血管模型中，EPCs能结合到血管损伤部位，促进血管再内皮化［6］。

在心血管病介入治疗中，药物洗脱支架（drug eluting stent，DES）已得到广泛应用，目前美国食品和药品监督管理局（FDA）批准的DES为紫杉醇洗脱支架和雷帕霉素洗脱支架。雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，具有抗血管形成、抗肿瘤生长的作用。其与细胞内雷帕霉素连接蛋白结合形成的复合物能抑制调节性激酶－雷帕霉素耙（target of rapamycin，TOR），抑制细胞转录过程，从而使细胞分裂受阻于G1期而不能进入S期。在增殖分化的EPCs中也存在调节性激酶TOR，因此雷帕霉素能抑制EPCs的增殖和分化。雷帕霉素可降低体外培养的人外周血来源的EPCs的数量，抑制其增殖、迁移、黏附和血管形成，并抑制内皮一氧化氮合成酶（eNOS）产生［7］。本实验结果显示，雷帕霉素可以降低体外培养的大鼠骨髓来源的EPCs的数量，并抑制其增殖、迁移、黏附的能力，且呈浓度依赖性。

紫杉醇是一种抗增殖药物，它可与微管蛋白结合，稳定微管结构，阻断细胞有丝分裂，从而抑制细胞的增殖。低剂量的紫杉醇可通过诱导p53／p21肿瘤抑制基因，影响细胞分裂的G0－G1及G1－S期；而高剂量紫杉醇则影响细胞分裂的G2－M期和M－G1期，可能会导致细胞坏死或凋亡。本实验结果显示，紫杉醇降低了体外培养的大鼠骨髓来源的EPCs的数量，并且可以抑制其增殖、迁移、黏附的能力，且呈浓度依赖性。

DES的应用显著降低了支架内再狭窄的发生率，但也导致了血管内皮化延迟以及支架内血栓发生率的增加。雷帕霉素和紫杉醇对EPCs的抑制作用可能是导致内皮化延迟的原因之一，因而用药物或细胞移植增加EPCs的数量并改善其功能可能会促进DES术后患者内皮的修复，降低支架内血栓发生率。体外实验［8］显示，恒磁场可促进EPCs的增殖和迁移，糖原合酶激酶－3β抑制剂加雷帕霉素包被支架可促进EPCs黏附，改善雷帕霉素导致的内皮化延迟。但目前促进内皮修复的办法尚不能达到理想的远期效果，需要继续探讨内皮修复的新措施。

［1］ Murohara T，Tepper O，Silver M，et al.Determination of bone marrow－derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor－induced neovascularization［J］.Exp Hematol，2002，30（8）：967－972.

［2］ Suzuki T，Nishida M，Futami S，et al.Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans.A case report of a Tokaimura nuclear accident victim［J］.Cardiovasc Res，2003，58（2）：487－492.

［3］ Gill M，Dias S，Hattori K，et al.Vascular trsuma induces rapid but transient mobilizing of VEGFR2（＋）CD133（＋）endothelial precursor cells［J］.Circ Res，2001，88（2）：167－174.

［4］ Shintani S，Murohara T，Ikeada H，et al.Mobiization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction［J］.Circulation，2001，103（23）：2776－2779.

［5］ Bhattacharya V，McSweeney PA，Shi Q，et al.Enhanced endothelialization and microvessel formation in polyester grafts sedded with CD34（＋）bone marrow cells［J］.Blood，2000，95（2）：581－585.

［6］ Walter DH，Rittig K，Bahlmann FH，et al.Statin therapy accelerates reendothelialization：a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow－derived endothelial progenitor cells［J］.Circulation，2002，105（25）：3017－3024.

［7］ Chen TG，Chen JZ，Wang XX，et al.Effects of rapamycin on number activity and eNOS of endothelial progenitor cells from peripheral blood［J］.Cell Prolif，2006，39（2）：117－125.

［8］ Ma XL，Hibbert B，Dhaliwal B，et al.Delayed re－endothelialization with rapamycin－coated stents is rescued by the addition of a glycogen synthase kinase－3βinhibitor［J］.Cardiovasc Res，2010，86（2）：338－345.