急性肝衰竭大鼠血清与组织中降钙素原的检测及意义

徐 虹 李 汛 王鲁文 龚作炯

武汉大学人民医院感染科 (湖北武汉，430060)

急性肝功能衰竭是一种病因复杂、进展快、病情重、病死率高的临床综合征，其发病机制复杂，尚未阐明。但目前大多数学者支持由病毒直接或间接 (免疫反应)所致的原发性损害;由内毒素及多种细胞因子如TNF-α、IL-4等介导的继发性损伤的“两次打击”学说［1］。降钙素原 (Procalcitonin，PCT)是无激素活性的前肽物质，是近年来新发现的一种具有高特异性和敏感性的炎症感染指标。本实验通过建立D-氨基半乳糖盐酸盐诱导的大鼠急性肝衰竭 (acute liver failure，ALF)模型，观察大鼠ALF时血清及组织中PCT水平的变化，探讨PCT与细胞因子变化之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备 将25只雄性Wistar大鼠 (武汉大学医学部动物实验中心，重200～220g)随机分为两组：①模型组20只，大鼠在禁食后12小时腹腔注射D-氨基半乳糖盐酸盐溶液 (江苏省启东市经贸有限公司)，每只大鼠注射的剂量为1.2g/kg;②正常组5只，于大鼠腹腔内注射等量生理盐水，24小时后处死。模型组大鼠在造模后12小时及24小时，分别取10只大鼠用10%水合氯醛麻醉，行心脏采血，分离血清，-80℃冻存备检。同时留取肝组织、脾组织、小肠组织各100mg，加入0.9%生理盐水350μl，冰上匀浆，4℃离心后取上清液，-80℃冻存备检。另取部分肝组织用10%甲醛溶液固定，行常规的石蜡包埋，切片，HE染色，观察肝组织的病理学改变。

1.2 检测指标与方法 ①血清及组织PCT的检测：采用ELISA法检测大鼠血清及肝脏、脾脏、小肠组织的PCT，实验步骤按试剂盒 (上海西唐生物科技有限公司)说明书操作。②血清细胞因子水平的检测：采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4，实验步骤按试剂盒 (美国eBioscience公司)说明书操作。③内毒素的检测：鲎试剂检测，实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用(±s)表示，采用两个独立样本非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义，相关性分析采用pearson检验。

2 结果

2.1 两组大鼠肝组织病理形态学变化 高倍镜下显示：正常组大鼠肝组织的肝小叶结构完整、清晰，肝细胞无变性坏死，炎症活动度分级及纤维化程度分期分别为G0、S0，HAI积分0。模型组大鼠12小时肝细胞片状坏死，肝索紊乱，炎症细胞浸润，肝组织炎症活动度为G3;24小时时肝细胞大块坏死，肝小叶结构失常，大量炎症细胞浸润，肝组织炎症活动度为G4。见插见图1。

2.2 两组大鼠血清PCT、TNF-α、IFN-γ、IL-4及内毒素水平变化 见表1。

正常组大鼠血清PCT的水平很低，PCT及TNF-α、IFN-γ、IL-4、内毒素在模型组12小时时已有升高，24小时时仍持续在较高水平，各组间比较差异有显著性意义 (P＜0.05)。

2.3 两组大鼠组织PCT水平变化 见表2。由表2可知，正常组大鼠的肝脏、脾脏、小肠组织中也可检测到PCT，但是在模型组12小时时迅速升高，24小时还持续在较高水平，各组间差异有显著性意义 (P＜0.05)。

2.4 相关性分析 模型组大鼠血清PCT(12小时或24小时)与TNF-α、IFN-γ、IL-4、内毒素 (12小时或24小时)成显著正相关 (P ＜ 0.05)，r值分别为 0.743，0.723，0.730，0.725，0.789，0.788，0.789，0.769。

表1 大鼠血清PCT与TNF-α、IFN-γ、IL-4及内毒素水平比较(±s)

表1 大鼠血清PCT与TNF-α、IFN-γ、IL-4及内毒素水平比较(±s)

与正常组比较，*P＜0.05

组别PCT(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)内毒素(EU/L)正常组0.025 ±0.008 1.068 ±0.956 12.53 ±0.885 0.096 ±0.401 0.291 ±0.019 ALF组12h 1.114 ±0.053*29.35 ±5.103*26.20 ±0.549*1.333 ±0.142*0.599 ±0.076*24h 3.134 ±0.093*28.45 ±5.17*34.29 ±0.348*1.087 ±0.266*0.849 ±0.008*

表2 两组大鼠组织PCT水平的比较 (ng/ml)

3 讨论

PCT是近年被发现的一种无活性的降钙素的前肽物质，由116个氨基酸组成，相对分子质量为13000，血中半衰期约为22～35小时，正常时由甲状腺的C细胞分泌。正常人体血中PCT水平很低［2］，组织中也存在PCT，以肝、胰、肾等含量相对较高。病理状态下肝、脾、胰、肺、肾、小肠等组织也能产生较高的PCT［3］。有文献报道，PCT是一种炎症性介质，可作为判断早期炎性反应的指标［4］。在全身炎症反应综合征、多器官功能障碍、败血症等严重感染时PCT相对于传统的感染标志物有着持续时间长，特异性高的优点，可以更好地预测病情的严重程度，病程的时间［5］。内毒素在革兰氏阴性细菌细胞壁的外层，其主要成分为脂多糖，正常时肠道内的内毒素被肝脏的枯否氏细胞解毒和清除。但在肝功能损害时，肝脏的枯否氏细胞的吞噬清除能力下降，内毒素经侧支循环进入体循环，而形成肠源性内毒素血症。临床上，肠源性内毒素血症越来越受到重视。肝硬化患者由于肠道微循环的改变，肠黏膜充血、肿胀，屏障功能降低致使肠黏膜通透性增加，肠道细菌增多向腹腔中移位，并发腹腔感染。肝功能损害时，内毒素作用肝脏后，引起多种细胞因子炎症介质的释放，如TNF-α，导致免疫损害，可加重肝功能的损害，易合并细菌感染。可见内毒素血症与肝损害两者互为因果，关系密切，随着内毒素水平的增加，肝损害的程度亦逐步加重［6］。Dandona等在健康人体内注射入小剂量内毒素后，于1、2、4、6、8、24小时检测血浆 PCT水平，在两小时后可检测到少量PCT，4～6小时迅速升高，8～24小时达到高峰，2到3天后逐渐恢复到正常水平［7］。在急性胰腺炎时，血清PCT的水平可较早地评估病情的程度。急性坏死性胰腺炎时，血内毒素的水平则可提示肠源性感染［8］。据文献报道，内毒素及细胞因子 TNF-α、IL-6等可能刺激和诱导了PCT的产生［9］。本实验结果提示，在急性肝衰竭并发感染时监测PCT的水平可以较早地诊断和评估病情。本实验结果还提示，PCT在急性肝衰竭的发病中起着重要的作用。在正常组大鼠的肝脏、脾脏、小肠组织中可检测到PCT，模型组大鼠的肝脏和小肠的PCT含量明显升高。这可能与肝损害时机体器官功能的改变存在着一定的关系。在肝组织的病理形态学上，正常组大鼠肝组织肝小叶结构清晰，肝细胞无变性坏死;在模型组大鼠12小时，肝细胞片状变性、坏死，炎性细胞浸润，模型组大鼠24小时，肝细胞大片坏死，小叶结构失常，符合临床上急性肝衰竭患者的病情进展，这也与PCT水平升高的变化程度一致。

由以上结果可看出，PCT在急性肝衰竭的发生发展中起着重要的作用。急性肝衰竭时，血清和组织中，如肝脏、小肠PCT均升高，可能与肝脏、肠道功能的改变有着一定的关系。PCT的升高对急性肝衰竭时，重症感染及脓毒血症的临床诊断，抗生素的选择应用可提供参考作用。

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