高效液相色谱法测定人血浆中酮咯酸浓度

刘雪松，慕杨娜，姜春梅，李国信

酮咯酸(Ketorolac)为吡咯酸的衍生物，属非甾体抗炎药，镇痛作用近似阿司匹林，肌注后镇痛作用近似中等量吗啡。肝代谢产物羟基酮咯酸有抗炎、镇痛作用，以原型由肾脏排泄。临床用于缓解中度至重度的术后疼痛，及与外伤有关的急性肾绞痛和与癌症有关的内脏疼痛等［1-2］。本实验采用HPLC法测定人血浆中酮咯酸浓度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外检测器(LC solutionlite色谱工作软件，日本岛津公司)。酮咯酸氨丁三醇对照品(含量:99.72%，批号:ABBH002305)，奥硝唑原料药(含量:99.4%，批号:090131069)，酮咯酸氨丁三醇胶囊(尼松，规格:10 mg/片，批号:090801，山东新时代药业有限公司生产)，甲醇、乙腈(均为山东禹王实业有限公司化工分公司，色谱纯)，磷酸二氢钠(汕头市西陇化工有限公司，分析纯)，氢氧化钠(沈阳市正信科技研究所试剂部，分析纯)。

1.2 色谱条件 Platisil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈(70∶30)(2 mol/L氢氧化钠调节pH值至5.14±0.01);检测波长为 330 nm;流速为1.0 mL/min。

1.3 酮咯酸标准溶液及内标溶液配制 精密称取酮咯酸氨丁三醇对照品适量(含量99.72%，约相当于酮咯酸10 mg)，置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100.0 μg/mL的酮咯酸储备液;再用50%甲醇溶液逐级稀释成质量浓度分别为24.8、49.6、99.2、248.0、496.0、992.0、2 480.0 μg/mL 的系列标准溶液。精密称取奥硝唑原料药适量(含量99.4%，相当于奥硝唑10 mg)，置100 mL量瓶中，50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100.0 μg/mL的内标储备溶液，精密量取内标储备液7.0 mL至100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成浓度为7.0 μg/mL的内标溶液。

图1 专属性考察色谱图

1.4 血浆样品处理方法 取血浆样品300 μL置1.5 mL离心管中，加入50%甲醇溶液30 μL，加入内 标 溶 液 (7.0 μg/mL 奥 硝 唑)30 μL，甲 醇900 μL，涡旋60 s，离心8 min(15 000 r/min)，取出上清液400 μL置5 mL离心管中，40℃水浴中空气流下吹干，用400 μL流动相复溶，涡旋混合60 s，离心 5 min(15 000 r/min)，取上清液 50 μL进行分析。

2 结果

2.1 专属性考察 酮咯酸和内标保留时间分别为11.6 min和8.6 min。酮咯酸和内标奥硝唑分离度良好，血浆中内源性物质不干扰测定，色谱图见图1。

2.2 线性关系 精密量取空白血浆300 μL置1.5 mL离心管中，分别加入不同浓度的酮咯酸标准溶液各30 μL，配制成血浆中酮咯酸浓度为24.8、49.6、248.0、496.0、992.0 和 2 480.0 ng/mL的血浆样品，按“1.4”项下方法操作，制备酮咯酸标准曲线，进行双样本分析。以酮咯酸浓度(ng/mL)为横坐标X、酮咯酸与内标物的峰面积比值(As/Ai)为纵坐标Y，用加权最小二乘法(权重系数:1/X2)进行线性回归运算，求得的线性回归方程为 Y=-0.007 27+0.002 76X，r=0.999 7。结果表明，酮咯酸在24.8～2 480.0 ng/mL范围内线性关系良好。

2.3 精密度与准确度 精密量取空白血浆300 μL置1.5 mL离心管中，分别精密加入不同浓度的酮咯酸质控样品溶液各30 μL，配制成血浆中酮 咯 酸 为 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血浆样品，按“1.4”项下方法操作，连续制备并测定3 d，每日低、中、高3个浓度，每个浓度进行6样本分析，计算批内和批间的精密度(RSD)，结果见表1。

表1 精密度以及准确度

2.4 提取回收率的考察 精密量取空白血浆300 μL置1.5 mL离心管中，分别精密加入不同浓度的酮咯酸质控样品溶液各30 μL，配制成血浆中酮咯酸为 69.4(QC1)、396.8(QC2)、1 984.0(QC3)ng/mL的血浆样品，每个质量浓度进行6样本分析，将各色谱峰面积与相应质量浓度的标准溶液直接进样获得的色谱峰面积比较，计算本方法提取回收率，酮咯酸低、中、高3个浓度的回收率分别为 91.5% ±4.8%、95.7% ±1.6%和93.4% ±2.3%，内标回收率为90.5% ±3.2%。2.5 样品的稳定性 按“1.4”项下方法制备质量浓度分别为69.4和1 984.0 ng/mL的对照品血浆样品各21份。分别考察其在室温、冻融循环以及处理后样品在室温、冷冻条件下的稳定性，当日随行标准曲线计算血浆样品中酮咯酸的浓度，将测定浓度的平均值与理论浓度对照，所有测定结果偏差都在15%以内，表明血浆样品在室温放置7 h、血浆样品处理后室温放置25 h、血浆样品提取吹干后冷冻放置49 h、血浆样品3次冷冻-解冻循环条件下稳定性良好。

2.6 药动学研究中的应用 24名健康男性志愿受试者进食后30 min口服单剂量实验试剂20 mg，分别于给药前及给药后0.167(10 min)、0.333(20 min)、0.50(30 min)、0.75(45 min)、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、8.00、12.0、16.0、24.0 h 取静脉血，每一阶段总计取14个点(每点采血5 mL，遮光)，测定口服实验试剂后血浆中酮咯酸的浓度。采用Phoenix WinNonlin 6.0数据统计软件计算24名健康志愿者口服单剂量试验制剂20 mg的主要药动学参数，结果见表2。

表2 24名健康志愿者口服单剂量酮咯酸氨丁三醇胶囊20 mg的主要药动学参数

3 讨论

3.1 提取条件考察 实验过程中考察10%三氯醋酸沉淀法处理血浆样品，由于化合物对pH值敏感，血浆酸化处理后，待测物保留时间不稳定，有干扰峰，影响定量分析。改用甲醇900 μL处理样品后吹干浓缩，以流动相复溶，提高了低点浓度的响应值，避免了溶剂效应，提高了柱效，基线平稳，无内源性杂质干扰。

3.2 内标物选择 本实验分别应用酮咯芬、替硝唑等化合物作为内标物质，结果奥硝唑出峰时间合适，峰形良好。奥硝唑出峰时间对流动相的pH值敏感，可以通过调整流动相的pH值来调整化合物和内标的出峰位置，排除内源性物质的干扰。

3.3 检测波长确定 文献中大多选取315 nm为检测波长［3］，本实验中对酮咯酸氨丁三醇进行紫外扫描，发现其最大吸收波长为322 nm，并且在330 nm处仍有较强吸收，本实验最终确定检测波长为330 nm，进一步减少了内源性物质的干扰。波长扫描图见图2。

图2 酮咯酸氨丁三醇紫外波长扫描图

3.4 待测组分确定 酮咯酸氨丁三醇进入人体后迅速分解为活性物质酮咯酸［4］，由于没有市售酮咯酸对照品，只能采用酮咯酸氨丁三醇的对照品。本实验为了证明氨丁三醇不干扰待测物酮咯酸的检测，对氨丁三醇(2 mg/mL)进行了紫外扫描，结果显示，氨丁三醇在波长190～200 nm处有明显吸收，在330 nm处无吸收。因此，本实验中氨丁三醇不干扰待测物的检测。波长扫描图见图3。

图3 氨丁三醇紫外波长扫描图

3.5 药动学 Tmax和 Cmax与文献报道有差异［5］，文献报道禁食12 h后口服单剂量10 mg药物的Cmax为810 ng/mL，根据药动学线性关系计算单剂量给药20 mg后，Cmax应为1 620 ng/mL，而本实验为(1 351.7±310.9)ng/mL。此外，本实验中Tmax为(1.86±0.58)h与文献中的(0.89±0.63)h相差大约1 h。原因可能是食物减少了酮咯酸的吸收并延后了达峰时间。

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［1］陈阳，李建扬，吴兴林，等.酮咯酸氨丁三醇注射液用于急诊疼痛镇痛体会［J］.河北医药，2010，32(12):1611.

［2］Nagilla R，Deshmukh DD，Copedge KJ，et al.Enantiomeric disposition of ketorolac in goats following administration of a single intravenous and oral dose［J］.J VET Pharmacol Ther，2009，32(1):49-55.

［3］徐帆，余昉，尚北城.高效液相色谱法测定人尿中酮咯酸含量［J］.中国药房，2007，18(5):340-341.

［4］Raju B，Ramesh M，Borkar RM，et al.Development and validation of liquid chromatography-mass spectrometric method for simultaneous determination of moxifloxacin and ketorolac in rat plasma:application to pharmacokinetic study［J］.Biomed Chromatogr，2012，23(5):259-265.

［5］McAleer SD，Majid O，Venables E，et al.Pharmacokinetics and safety of ketorolac following single intranasal and intramuscular administration in healthy volunteers［J］.J Clin Pharmacol，2007，47(1):13-18.