黄曲霉毒素 B1诱导大鼠肝癌模型的建立

刘东璞,卢凤美,姚海涛,孟庆媛,盛延良,尹兴忠,王 抒

(佳木斯大学司法鉴定中心,黑龙江 佳木斯 154007)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)发病率位居全身恶性肿瘤第五,其死亡率列第三位,对人们的身体健康构成严重影响。目前公认乙型肝炎病毒(HBV)和黄曲霉毒素 B1(Aflatoxin B1,AFB1)与肝癌发生关系密切,其中AFB1已被世界卫生组织确定为人类第一类己知致癌物,是人类谷物和动物饲料中最常见得真菌毒素。本实验旨在建立AFB1诱导的大鼠肝癌模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只健康雄性 SD大鼠,体重180～220g,由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.2 实验方法

将 40只 SD大鼠随机将其分为两组:(1)AFB1组(25只),于第三周开始腹腔注射 AFB1:第3～16W:200μ g/kg体重 ,3次 /W;第 22～ 30W:100 μg/kg体重 ,2次 /W;第 35～45W:100 μg/kg,1次 /W。

(2)对照组 (15只),于第一周开始饲食正常饲料直至实验结束。不给 AFB1处理。

分别于实验第18W、32W、55W于大鼠大腿内侧近腹股沟处经股静脉穿刺抽血约1.5mL,离心后留取血清标本于-40℃冰箱保存。

第60W断颈处死全部大鼠,解剖大鼠常规留取有肿块的肝组织及数块肿块旁肝组织,所取肝组织切取一部分放入10%中性福尔马林溶液内固定24h后常规石蜡包埋,用于HE染色及免疫组织化学染色;剩余部分立即投入液氮速冻后再转入-80℃冰箱保存备用。血清按照试剂说明书以酶联免疫吸附法(ELISA)检测 AFP水平。

2 结果

2.1 肝癌模型的成功率

实验结束(第 60W)时 ,AFB1组有效动物数为25只,20只发生恶性肿瘤 ,其中2只为胆管上皮细胞癌,其余为肝细胞肝癌 (HCC);PHC发生率为80%(20/25)。对照组 15只,无肿瘤发生。

2.2 肝癌发生过程中大鼠血清 AFP的变化

酶联免疫吸附法 (ELISA)检测大鼠血清 AFP水平,随着模型组 AFB1诱导周数的增加肝脏体积增大,肝细胞弥漫性脂肪变,血清 AFP明显升高 (P＜0.05)。对照组大鼠AFP水平无明显变化。详见表1。

表1 肝癌发生过程中大鼠血清 AFP的变化 (±s,ng/mL)

表1 肝癌发生过程中大鼠血清 AFP的变化 (±s,ng/mL)

与正常组相比aP＜0.05;模型组之间相比bP＜0.05。

分组/只 18周 32周 55周AFB1(25) 120.63± 5.34a、b 242.63± 5.64a、 b 420.63± 6.34a对照组(15) 81.63±5.41 120.63± 5.34 240.63±5.26

2.3 病理组织学观察

2.3.1 大体观察

大体观察肝脏表面肿块散在分布,呈结节隆起状;巨块型一例伴肝硬化;另有肿块呈明显的菜花状,肿块中心有坏死。对照组大鼠肝脏表面较光滑,质地柔软。

2.3.2 光镜观察

组织学观察癌细胞呈不规则形,以中、低分化为主。癌细胞体积明显增大,胞浆呈弱嗜碱性,核 /浆比例增大 ,细胞核染色加深,形状不规则。另外 AFB1组还有2例胆管上皮细胞癌和2例肝癌肾转移。肝门管区常可见到纤维结缔组织增生及炎细胞浸润,非肿瘤肝组织内可见小叶结构清楚完整,肝细胞增生灶、增生结节或部分肝细胞排列成双行、多行甚至成小片状。

对照组肝索围绕小叶中央静脉呈放射状排列,肝细胞排列整齐,核大小一致,分布均匀 ,肝窦清晰,肝细胞无明显增生改变。

3 讨论

建立肝癌动物模型是进行肝癌实验研究的重要平台和手段。目前建立肝癌模型的方法较多,可分为种植性、诱发性、自发性及转基因动物肝癌模型等。诱发性肝癌模型是进行肿瘤学实验研究的常用方法,它采用物理、化学、生物等致癌因素在实验条件下诱发动物发生肝癌。其中 AFBl诱发肝癌模型是目前应用最为广泛的一种方法[1～7]。真菌毒素AFB1常见于人类食物和动物饲料中,具有很强的肝毒性和遗传毒性,因此被列为人类的致癌物。

本实验 AFB1腹腔注射剂量的选择是在前期多次动物实验的基础上的动态调整。历时一年余建模成功,实验组恶性肿瘤发生率为80%,而对照组无肿瘤发生,上述结果表明大鼠肝癌为 AFBl所诱发,而非“自发性”肿瘤。因此本实验肝癌模型的建立是成功的。虽然本实验应用小剂量 AFB1诱癌时间较长,但符合实际暴露于 AFB1的人群是长期低水平摄入的情况,因此本实验设计很好的模拟人群的实际情况。AFB1诱发的肝癌与自然发生的人类肝癌相似,肿瘤多为单发性,肿瘤细胞的组织形态与人的肝癌细胞相似,其中 HCC比例高。综上所述该方法比较成熟,建立的模型较稳定,对于实验观察和分析药物对肝癌的干预作用是较为理想的动物模型。

血清 AFP水平是最常用诊断肝癌实验室指标。20世纪60年代 Kores[8]最早报道了在 AFB1诱发大鼠 PHC的过程中伴有血清 AFP浓度的升高 ,本实验由18～55W,三组实验动物血清 AFP均增高,其中 AFB1组最显著。对照组 AFP水平升高 ,但 ＜300ng/mL,考虑可能与阶段性肝活检有关,反复的活检致使肝损伤造成肝细胞增殖。有研究报道在慢性肝脏疾病中血清 AFP增高,范围21～ 225ng/mL区间,一般不超过400ng/mL[9],本研究与此相符。实验的第 32W和55W,AFB1组血清 AFP的水平均显著高于对照组。

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[5]李缓,苏建家,覃柳亮,等.OLT对 AFBI致树韵肝癌前病变的化学诱发作用 [J].癌症,1999,18(1):34-36

[6]曹骥,李缓,张丽生,等.茶多酚在树韵肝癌形成中的化学预防作用 [J].肿瘤,2005,25(2):118-121

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[8]Kores RM,Sontag JM,Weisburger JH,et al.α-Fetoprotein in rats with hepatomas induced by aflatoxin Bl[J].Nature,1972,240(5378):240-241

[9]Yamashita F,Tanaka M,Satomura S,et al.Prognostic significance of Lens culinaris agglutinin A-reactive alpha-fetoprotein in small heatocellular carcinomas[J].Gastroenterology,1996,111(4):996-1001