雷帕霉素纳米粒滴眼液兔眼部药物分布研究

姜 伟,王玉清,刘远光,宿星杰,齐艳秀,张 剑,曹丽辉,王冬兰

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

免疫排斥反应是引起高危角膜移植手术失败的主要因素(发生排斥率≥60%)。雷帕霉素(Rapamycine,RAPA)作为强效免疫抑制剂已在器官移植中获得广泛应用,但穿透性角膜移植术后全身应用 RAPA副作用大,治疗费用昂贵;而RAPA一般滴眼液难于在眼内达到有效的治疗浓度[1]。因此,探索 RAPA局部用药新剂型,对高危角膜移植术后免疫排斥反应的防治具有重要意义,为临床治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 RAPA纳米粒的制备与药物的配制

由天津大学材料工程研究学院将 RAPA和聚乳酸/胆固醇改性壳聚糖(PLA/Cs-Chol)混合,制成 RAPA纳米粒,PLA和 Cs-Chol的重量比为1:5,颗径平均为300纳米 ,以灭菌注射用水配置成0.5%RAPA纳米粒滴眼液。

1.2 动物分组与滴眼

体重 2～ 3kg健康新西兰大白兔 40只,查无眼病,随机分为 实验 组 与对 照组 ,每组 20只 ,分别给 药后 15、 30、 60、 360、720min取材进行观察。用微量取样器给药:对照组每眼结膜囊内单次滴0.5%RAPA滴眼液 50 μL;实验组每眼结膜囊内单次滴0.5%RAPA纳米粒滴眼液50μL。

1.3 组织样品收集

滴眼后分别于不同时间点用带27号针头一次性注射器抽取房水,精密吸取100μL。将家兔耳缘静脉注射消毒空气处死,用0.9%氯化钠溶液冲洗眼球后,取角膜,滤纸吸干并称重。所有样品以液氮速冻后储存于-80℃低温冰箱备用。药物浓度采用高效液相色谱法(HPLC)测定。

1.4 样品处理方法

取房水100μL加6%高氯酸甲醇溶液 100 μL混匀,4000r/min,离心 15min,取上清液 40μL注入液相色谱仪中 ,测定峰面积。以峰面积代入回归曲线,求得所测试样品浓度。角膜的处理:将角膜剪碎加重蒸水750 μL,用组织捣碎机粉碎角膜样品,加等体积6%高氯酸甲醇溶液混匀,以下过程同房水的处理。上清液用0.45 μm的滤膜过滤,取 40 μL注入色谱仪中 ,求得样品的量后除以角膜质量即得角膜中药物浓度。

1.5 药物分析方法

HPLC高效液相色谱仪为 Waters高效液相色谱仪。色谱柱为 Supelcosil LG-18DB柱 (4.6mm× 250mm,5μ m);柱温50℃。流动相:甲醇:水=75:25;流速 1.0mL/min。检测波长276nm,进样体积为 20 μL,峰面积与浓度作线性回归,对照品房水溶液配制标准曲线的浓度系列为 2、10、20、30和40ng/mL。

1.6 统计学分析方法

应用 SPSS10.0统计学软件,用 t检验比较两种滴眼液滴眼后房水及角膜中 RAPA浓度之间差异。P＜0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 RAPA在兔眼房水中的浓度变化

单次给0.5%RAPA滴眼液及其纳米粒滴眼液后,测量不同时间点对照组与实验组房水中 RAPA浓度,并对房水中 RAPA浓度作 t检验 (表 1)。结果表明:15～ 720min时 ,两组房水 RAPA浓度差异有统计学意义 (P＜0.05),实验组明显高于对照组。实验组30～ 720min各时间点房水中的药物浓度比较无统计学差异 (P＞ 0.05)。

2.2 RAPA在兔眼角膜中的浓度变化

单次给0.5%RAPA滴眼液及其纳米粒滴眼液后,测量不同时间点对照组与实验组角膜中 RAPA浓度,并对角膜中 RAPA浓度作 t检验 (表 1)。结果表明:15～ 720min时 ,两组角膜中 RAPA浓度差异有统计学意义 (P＜0.05),实验组明显高于对照组。实验组30～ 720min各时间点角膜组织中的药物浓度比较无统计学差异 (P＞ 0.05)。

表1 各组兔眼用药后不同时间点房水及角膜中的 RAPA浓度(±s,ng/mL,n=8)

表1 各组兔眼用药后不同时间点房水及角膜中的 RAPA浓度(±s,ng/mL,n=8)

时间(min)房 水纳米粒滴眼液 一般滴眼液角 膜纳米粒滴眼液 一般滴眼液15 4.52± 1.32 0.00± 0.00 18.51± 5.65 5.24± 2.43 30 10.09± 0.78 0.16± 0.03 30.09± 3.03 3.83± 1.79 60 9.92± 2.07 0.18± 0.14 29.73± 4.97 1.08± 0.52 360 11.17± 1.34 0.00± 0.00 31.12± 3.07 0.00± 0.00 720 10.05± 0.79 0.00± 0.00 28.65± 2.43 0.00± 0.00

3 讨论

眼病的药物治疗一直是困扰广大眼科医生难题,全身用药由于“血-眼屏障”的影响,难以在眼部达到有效治疗作用,且药物在体内蓄积会引起毒副作用,治疗成本高,而局部用药是眼病治疗的主要途径。常规眼部给药剂型由于角膜屏障和泪液稀释难以在眼内达到理想的药物浓度。新的药物控释剂型的出现克服了常规全身和局部用药方式的不足,且能在眼内达到较理想且稳定的药物浓度,为难治性眼病(尤其是慢性眼病)的治疗提供了新方法。

药物控释系统能够将药物在特定时间内恒速释放作用于靶器官,并维持有效药物浓度。Chawla[2]等人发现载抗肿瘤药纳米粒缓释剂能延长药物作用肿瘤时间,减缓肿瘤生长速度,同单纯用药相比显著延长了肿瘤动物模型的存活时间。1970年 Yolles等率先将 PLA用作药物长效释放剂载体[3]。壳聚糖 (Cs)是目前研究最多的多糖类天然高分子,具有生物相容、可降解及黏膜黏滞等特性,已被用作多种医用品[4]。而经过胆固醇改性壳聚糖(Cs-Chol)作表面修饰材料,同时具有乳化和表面修饰作用,用做表面活性剂同 PLA载药粒连接,可使载药粒更好的与黏膜结合,通过载药粒中药物持续向外释放,达到了向眼部持续给药、延长药效的作用,具有方便,无需手术的特点。实验中0.5% RAPA纳米粒滴眼液组和 RAPA一般滴眼液组前房内不同时间房水 RAPA浓度比较发现:实验组前房 RAPA浓度在治疗期间较对照组明显增高 (P ＜ 0.05),30、60、360,720min实验组组间两两比较差异无统计学意义 (P＞ 0.05)。这提示 RAPA纳米粒滴眼液能向眼部有效、持续平稳给药。

WRIGHT等发现,RAPA抑制混合淋巴细胞反应50%的药物浓度为0.3μ g/L[5],因此眼部 RAPA须达到一定药物浓度才能抑制眼部淋巴细胞的增殖和活化。姜伟等[6]发现应用0.5%RAPA纳米粒滴眼液能显著延长高危角膜移植术后植片存活时间。高华等[7]等发现,当兔眼房水中 RAPA药物浓度＞ (1.101±0.255)μg/L时,能有效抑制兔眼高危角膜移植术后免疫排斥反应和角膜新生血管生成。我们单次局部用0.5%RAPA纳米粒滴眼液50μL滴眼后,兔眼房水及角膜中 RAPA浓度在 15～720min内均远高于此水平 ,房水中RAPA浓度在 720min时为10μg/L左右,是有效治疗浓度的10倍左右。在15～ 720min,RAPA纳米粒滴眼液组角膜和房水中 RAPA浓度明显高于一般滴眼液组。同 RAPA一般滴眼液相比 RAPA纳米粒滴眼液能够提供有效的药物治疗浓度,而且在较长时间内维持较高而平稳的药物水平,降低给药次数,从而增加患者的依从性。

[1]De Rojas Silva MV,Rodriguez Ares M T,Sanchez Salorio M,et al.Efficancy of subconjunctiv al cyclosporine containing microsperes on keratoplaty rejection in the rabbit[J].Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol,1999,237:840-847

[2]Chawla JS,Amiji MM.Biodegradable poly(caprolactone)nanoparticles for tumor-targeted delivery of tamoxifen[J].International Journal of Pharmaceutics,2002,249:127-138

[3]Yolles S,Eldridge JE,Woodland JHR.Sustained delivery of drugs from polymer/drug mixtures[J].Polymer News,1970,1(4):9-12

[4]Petri FA,Kennedy JF.Application of Chitin and Chitosan[J].Carbohydrate Polymers,1998,34(4):414-417

[5]Wright D,Deol H,Tuch B.A comparison of the sensitivity of pig and human peripheral blood mononuclear cells to the antiproliferative effedts of trational and newer immunosuppressiv e agents[J].Transpl Immunol,1999,7:141-147

[6]姜伟,孙慧敏,李筱荣,等.雷帕霉素纳米粒滴眼液联合环孢霉素A缓释膜治疗兔高危角膜移植术后免疫排斥反应的研究 [J].中华眼科杂志,2009,45(6):550-556

[7]高华,史伟云,谢立信,等.雷帕霉素缓释片防治兔高危角膜移植免疫排斥反应和新生血管增殖的研究 [J].中华眼科杂志,2006,42(1):6-11