小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达

高华峰，信爱国，高 林，杨仕标

（云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，昆明 650024）

小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副粘病毒科、麻疹病毒属的成员，因主要感染小反刍动物而得名，特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织（OIE）将PPRV感染列为A类疫病，中国也将其列为一类动物疫病。该病主要在非洲及中东地区流行，近年来在中国周边国家频繁发生，自2007年西藏自治区首次报道该病疫情以来，现已严重威胁我国畜牧业的健康发展[1-3]。

血凝素蛋白H蛋白是小反刍兽疫病毒的结构蛋白之一，又称附加蛋白，构成病毒的纤突，含609个氨基酸，是最易变异的蛋白，这种高度的变异性可能是免疫压力选择的结果。H蛋白同时具有血凝素和神经氨酸酶的功能，且含有T细胞决定簇，可能与宿主细胞的特异性有关。H蛋白在病毒与细胞膜结合过程中作为受体，是引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)的决定因素[4]。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠埃希氏菌DH5α、DH10Bac（含Bacmid和Helper）、转座质粒pFastBacHT、小反刍兽疫病毒N75/1弱毒疫苗株及全长cDNA文库由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存。

1.2 细胞与培养基 昆虫传代细胞系Sf9为云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存；Grace's昆虫培养基及胎牛血清购自Gibco公司。

1.3 酶及试剂 各种工具酶均购自TaKaRa（大连）生物工程工司；蛋白质分子量标准购于晶美公司；PCR产物回收试剂盒及凝胶回收试剂盒为上海生工产品；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）为Promega公司产品；组氨酸His单抗、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗购自碧云天；引物合成及DNA测序由上海生工完成。

1.4 小反刍兽疫病毒的PCR扩增 根据小反刍兽疫病毒N75/1毒株序列，合成如下引物用于目的基因的扩增。上游引物的5'端设计了BamH I酶切位点，在下游引物的5'端设计了XbaI酶切位点，质粒进行PCR扩增：94℃预变性3 min；94℃变性1min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共进行18个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增片段胶回收纯化后4 ℃保存备用。

1.5 序列测定及分析 回收H基因PCR产物与pMD19-T载体室温4 h连接后，转化DH5α感受态细胞，涂板后14 h培养挑选白色的细胞进行BamH I和XbaI双酶切鉴定，鉴定出的阳性克隆送上海生要进行序列测定。

1.6 重组表达载体的构建 序列测定正确的H双酶切阳性片段分别与双酶切的pFastBacHT载体在T4 DNA连接酶作用下16℃连接16 h，构建pFastBacHT-H真核表达转移载体，然后转化DH5α感受态细胞，涂板后培养14 h挑选构建pFastBacHT-H细胞，进行BamH I和XbaI双酶切鉴定。鉴定出的阳性克隆提取质粒，电转化带有Bacmid及Helper的DH10Bac感受态细菌，涂布X-gal及IPTG的筛选平板（含卡那霉素及四环素抗性），筛选白色菌落进行PCR鉴定，所用的通用引物为Puc/M13。

1.7 重组质粒转染昆虫细胞 将提取的重组质粒与脂质体混匀，加入Grace's细胞培养基（无血清及抗生素）混匀后室温结合1 h，共转染生长良好的低代次Sf9细胞，培养8 h后，再取出培养瓶，弃上清后加入含血清和双抗的Grace's细胞培养基，28℃继续培养并观察细胞病变。

1.8 SDS-PAGE电泳及Western blot检测 重组杆状病毒培养3～4代后，分别收集细胞及血清，进行SDS-PAGE电泳，同时加入同样处理的昆虫细胞作为阴性对照。将SDS-PAGE电泳产物转移至硝酸纤维膜上，重组蛋白用含5%脱脂乳的TBST封闭4℃过夜，以抗6His标鉴蛋白的单抗结合1 h后，用NBT及BCIP显色，观察其特异性条带。

2 结果

2.1 小反刍兽疫病毒H基因PCR扩增 小反刍兽疫病毒H基因PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，在1830 bp处出现特异性条带，大小与预期相符（图1）。

图1 H基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 The RT-PCR amplif i ed results of H gene

2.2 重组转座载体的构建 将小反刍兽疫病毒H基因PCR产物及转座质粒pFastBacHT酶切回收后，经连接酶连接后，筛选出重组转座质粒pFastBacHT-H（图2）。

2.3 含目的基因的重组Bacmid的筛选与鉴定 将重组质粒pFastBacHT-H转化DH10Bac感受态菌后，在含卡那霉素、四环素、IPTG和X-gal平板上挑取白色菌落并抽提质粒，抽提的质粒用PCR鉴定（图3）。

2.4 重组病毒的细胞病变 将重组杆状病毒在Sf9细胞上连续传代，经3代后，H基因在昆虫杆状病毒系统中表达后，昆虫细胞出现细胞融合、核浓缩等细胞病变（图4）。

图2 转移载体的酶切鉴定Fig.2 Identif i cation of pFastBacHT-H

图3 重组Bacmid的PCR鉴定结果Fig.3 Identif i cation of recombinant plasmid by PCR

图4 H基因重组杆状病毒的细胞病变效应Fig.4 Cytopathic effect(CPE) of H gene recombinant bacmid

2.5 表达产物的SDS-PAGE和Western blot检测将重组杆状病毒在Sf9细胞上连续传代，经3～4代后，收集培养物，将培养物上清及细胞沉淀分别用于SDS-PAGE分析，可见H基因在昆虫杆状病毒系统中得到表达，表达产物的分子质量约为46 ku，H蛋白抗6His（祖蛋白）标鉴蛋白的单抗进行检测，可观察其特异性条带（图5）。

3 讨论

小反刍兽疫病毒具有红细胞吸附能力，纯化后的病毒能吸附多种动物红细胞，其吸附能力对鸡和猴子的最强，而对人，狗、山羊及绵羊的吸附能力稍差。瞬时表达于细胞表面的重组血凝素蛋白具有凝结鸡红细胞的生物学活性，表明该病毒的吸附能力并不依赖于病毒的其他蛋白组分。表达于CV-1细胞的重组血凝素蛋白H还具有神经氨酸酶活性，这种活性通过2、3糖苷键连接的底物起作用，氮糖基神经氨酸和胎球蛋白是两种广泛被利用的底物。对小反刍兽疫病疫苗毒株Nig75/1和强毒株Ind/TN87/1 H蛋白分析表明强弱毒株结合的底物相同，但强毒株Ind/TN87/1 H蛋白对氮糖基神经氨酸的结合能力高于疫苗毒株[5,6]。

图5 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot检测Fig.5 SDS-PAGE and Western blot analysis of His-H protein

昆虫细胞表达系统广泛用于大量生产外源重组蛋白。为表达小反刍兽疫病毒H蛋白，本试验构建了重组杆状病毒，由于小反刍兽疫病毒H及F蛋白属于副粘病毒膜整合糖蛋白，H蛋白定位于病毒表面，其免疫原性在表达过程中因融合而增强，重组

病毒及病毒样粒子在复制过程中携带大量抗原表位，可作为亚单位疫苗的候选蛋白，H起到将病毒粘附于靶细胞表面的功能，协助F蛋白完成病毒与细胞的融合[7,8]。

小反刍兽疫核蛋白N蛋白的杆状病毒表达产物作为抗原广泛用于竞争ELISA试剂中[9]，用于血清学检测及疫苗免疫效果分析。本试验所表达的H蛋白，将用于尝试作为ELISA的包被抗原，对国内小反刍兽疫进行血清学检测。

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