胡椒碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

郑 斌，王 欣，麻彤辉＊

（1.吉林大学 白求恩医学院，吉林 长春 130021；2.吉林大学第二医院 中心实验室，吉林 长春 130041）

胡椒碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

郑 斌1，王 欣2，麻彤辉2＊

（1.吉林大学 白求恩医学院，吉林 长春 130021；2.吉林大学第二医院 中心实验室，吉林 长春 130041）

目的 探讨胡椒碱（piperine）对人HpeG2肝癌细胞株的增殖、杀伤和细胞凋亡的影响，为肝癌的治疗提供理论依据。方法体外培养的HpeG2细胞，采用MTT比色法检测不同浓度胡椒碱对体外培养的HepG2细胞和新分离的外周血白细胞的增殖抑制作用。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态，采用流式细胞术测定胡椒碱对HepG2细胞的凋亡。结果胡椒碱对HepG2细胞增殖的抑制率随着浓度的升高而增加，半量抑制浓度（IC50）为15.13±3.21μmol／L，低于其对外周血白细胞的抑制率（64.52±5.32μmol／L）。Hoechst 33258染色后，胡椒碱处理癌细胞组表现出典型的细胞凋亡特征，流式细胞仪检测20μmol／L的胡椒碱处理HepG2细胞24h后，细胞凋亡率由对照组的2.89%上升到了21.76%。结论胡椒碱具有抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的抗肿瘤活性，有应用于肝癌治疗的潜在价值。

胡椒碱；肝癌；HepG2；细胞凋亡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0218）

Pradeep CR等人［1研究发现胡椒碱可抑制B16F-10黑色素瘤诱导的肺转移，明显减少肿瘤的形成，延长荷瘤小鼠存活期。这说明胡椒碱有抗肿瘤转移的作用。但是未见胡椒碱对人肝癌HepG2细胞的报道，本文报道胡椒碱在体外对人肝癌HepG2细胞株生长及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂胡椒碱（中国药品生物制品检定所），1640培养基（sigma），DMED 培养基（sigma），四甲基偶氮唑盐（MTT试剂盒）（罗氏诊断），胎牛血清（Hyclone），Hoechst 33258（sigma），细胞凋亡试剂盒（碧云天生物技术研究所），人外周血白细胞分离液（天津TBD公司），细胞板（corning），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），多功能酶标仪（美国Thermo公司）。

1.2 细胞培养HepG2细胞株，由本实验室传代保存，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5%的CO2培养箱中培养。人外周血由志愿者提供，按公司说明书分离外周血白细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3 MTT比色法测定胡椒碱对HepG2和白细胞的增殖抑制作用移除细胞培养液后，加入0.25%胰酶消化细胞，弃胰酶，加入10ml培养基，用移液器吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度，以每孔5000细胞铺满96孔板，12h后移除培养基，加入含不同浓度胡椒碱（自200μmol／L以下倍比稀释到1.56 μmol／L）的培养基100μl，另设空白孔（只含培养基）和对照孔（不加入胡椒碱）。细胞与药物在37℃，5%CO2共孵育18h后，每孔加入10μl MTT溶液（10mg／ml），共孵育4h后，加入 MTT溶解液100μl，37℃孵育过夜后，在590nm波长下测定各孔的吸光度（A值）。计算细胞增殖抑制率。抑制率＝1－（实验孔－空白孔）／（对照孔－空白孔）×100%。实验重复三次。测定胡椒碱对外周血白细胞的增殖抑制同上。

1.4 Hoechst 33258染色观测细胞核形态细胞接种于24孔板，培养和药物处理24h后，75%乙醇室温固定15min，去除固定液，PBS洗三次，用10μg／ml Hoechst 33258溶液对正常细胞和胡椒碱处理的细胞进行细胞核染色，避光孵育30min后，在倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态，并照相记录。

1.5流式细胞仪测定胡椒碱对HepG2细胞的凋亡的影响上述细胞接种于12孔板中，每孔105个细胞，20μmol／L的胡椒碱处理24h后，0.25%胰蛋白酶消化，1000r／min离心5min收集细胞，用结合缓冲液重悬细胞，先后加入Annexin V-FITC避光染色5min，离心，重悬，加入PI染液避光染色10 min，上机检测细胞凋亡情况。

1.6统计学处理所有计量资料均以均值±标准差表示，采用SPSS17对数据结果进行单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的胡椒碱对HepG2细胞和外周血白细胞的增殖抑制作用不同浓度的胡椒碱处理HepG2细胞24h后，细胞增殖抑制随着药物浓度增加而升高，IC50为15.13±3.21μmol／L，剂量－抑制曲线如图1，胡椒碱对外周血白细胞的增殖抑制作用也呈剂量依赖方式，其IC50为64.52±5.32 μmol／L大于其作用于肝癌细胞的IC50，表明胡椒碱对人外周血白细胞的毒性较HepG2细胞毒性小。剂量抑制曲线如图2。

2.2Hoechst 33258染色观察细胞核形态变化细胞经处理，固定染色后，对照组的细胞核发均一的蓝光，而胡椒碱处理的细胞，细胞核破坏，细胞核内的DNA被酶裂解片段化，与其他细胞器一起组成凋亡小体，凋亡小体内的DNA与Hoechst 33258结合，发出碎块状的浓密亮蓝色。见图3。

2.3胡椒碱对HepG2细胞凋亡的影响20μm胡椒碱处理引起HepG2细胞的凋亡率和死亡率都明显高于对照组，见图4，结果表明，胡椒碱可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。

图1 不同浓度胡椒碱对HepG2细胞增殖的影响

图2 胡椒碱对白细胞活力的影响

图3 细胞核形态对比分析（Hoechst 33258染色，A对照组，B为20μM胡椒碱处理24h，400×）

图4 Annexin V-FITC／PI双染色后，流式细胞仪检测胡椒碱对HepG2细胞凋亡的影响

3 讨论

原发性肝癌（简称肝癌）是由肝细胞或者肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤，在我国的恶性肿瘤发病中居第二位，全世界肝癌新发病人的45%分布于中国大陆。肝癌极具侵袭性，预后差。目前肝癌主要是手术干预（肝切除和肝移植）和局部射频消融，这些方法只能对早期局部的小肿瘤疗效好，而更晚期的肿瘤则很难治愈［2］。现行肝癌治疗药物以阿霉素和5－氟尿嘧啶等最为常用，但是这些药物对患者的治疗有效率低且无明显延长寿命效果，因此寻找和开发新的特异性高疗效好的抗肿瘤药物成为肝癌治疗的焦点。

胡椒碱是从胡椒科植物果实中提取的一种天然的次生代谢产物，是一种广谱的抗癫痫药物［3］，Parmar等曾报道其具有解热、抗炎和降压的功效［4］，王玉芳等曾报道胡椒碱对白纹伊蚊C6／36细胞系的毒性作用，但药物诱导凋亡在细胞毒性作用中不占主导地位［5］，与本实验中流式细胞仪检测结果一致。

本实验表明，胡椒碱对人外周血白细胞的毒性较小，能以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡。具有重要应用价值。而Lakshmanan Vellaichamy等发现胡椒碱具有保护DMBA诱导的瑞士白化病小鼠的皮肤癌发生的潜力［6］。K Selvendiran发现，在苯并芘诱导的肺癌发生中，胡椒碱具有调节脂质过氧化过程和保护细胞膜结合酶类的作用［7］。

综上所述，胡椒碱具有重要的生物应用价值，尤其是在癌症的治疗方面，但是其作用机制尚待进一步研究。

［1］Pradeep CR，Kuttan G.Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B 1 6F-10melanoma cells in mice［J］.Clinical and Experimental Metastasis，2002，19：703.

［2］Sukowati CHC.Hepatic cancer stem cells and drug resistance［J］.World Journal of Hepatology，2010，2（3）：114.

［3］裴印权，岳 微，崔景荣，等.胡椒碱衍生化物的中枢药理作用研究［J］.药学学报，1980，4（15）：198.

［4］Virinder SP，Subhash CJ，Kirpal SB，et al.Phytochemistry of the Genus Piper［J］.Phytochemisrry，1997，46（4）：591.

［5］王玉芳，诸葛洪祥，周 霞，等.胡椒碱对白纹伊蚊C6／36细胞株的毒性作用［J］.昆虫学报，2007，50（5）：481.

［6］Lakshmanan V，Subramanian B，Kuppusamy P，et al.Chemopreventive potential of piperine in 7，12-dimethylbenz［a］anthracene induced skin carcinogenesis in Swiss albino mice［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2009，28：11.

［7］K.Selvendiran，D，Sakthisekaran.Chemopreventive effect of piperine on modulating lipid peroxidation and membrane bound enzymes in benzo（a）pyrene induced lung carcinogenesis［J］.Biomedicine ＆ Pharmacotherapy，2004，58：264.

Inhibitory effect of piperine on human HepG2hepatocarcinoma cell in vitro

ZHENGBin，WANGXin，MATong-hui.（JilinUniversity，BethuneMedicalSchool，Changchun130021，China）

ObjectiveTo study the inhibitory effect of piperine on HepG2cell in vitro.MethodsThe human hepatocarcinoma HepG2cells were cultured in vitro and divided into control group and piperine-treated group.MTT assay was performed to evaluate the proliferation inhibitory effects of piperine on HepG2cells and freshly prepared peripheral white blood cells.Hoechst 33258nuclear staining was performed to detect the mode of cell death.Flow cytometry was used to assess the effects of piperine treatment on cell apoptosis in human HepG2cells.ResultsThe inhibitory effect of piperine treatment on HepG2cell proliferation increases with the dose，and the half inhibition concentration（IC50）was 15.13±3.21μmol／L，which was lower than that for peripheral white blood cell（IC50＝64.52±5.32μmol／L）.Piperine treated HepG2cells showed typical apoptotic characteristics.After treated with 20μmol／L piperine for 24h，the apoptosis rate increased from 2.89%of control group to 21.76%.ConclusionPiperine has cytotoxicity effect on cultured human HepG2cells in vitro，and can inhibit proliferation and induce apoptosis.

piperine；hepatocarcinoma；HepG2；apoptosis

R735.7

A

1007－4287（2012）02－0218－03

吉林大学“大学生创新性实验计划”（2010A71109）

＊通讯作者

2010－11－29）