地高辛标记DNA探针快速筛选肿瘤细胞株基因表达差异

汪永强，殷运忠，李传达，袁平宗，罗 鹏，娄 冲

（1.内江市第二人民医院 检验科／泸州医学院附属内江医院，四川 内江 641100；2.重庆医科大学第一附属医院 检验科，重庆 400016）

地高辛标记DNA探针快速筛选肿瘤细胞株基因表达差异

汪永强1，殷运忠1，李传达1，袁平宗1，罗 鹏2，娄 冲1

（1.内江市第二人民医院 检验科／泸州医学院附属内江医院，四川 内江 641100；2.重庆医科大学第一附属医院 检验科，重庆 400016）

目的 建立寡核苷酸探针正向斑点杂交技术，快速筛选不同细胞株同一基因HIF-1a表达差异，探讨斑点杂交筛选基因表达的可行性。方法将多种培养肿瘤细胞株提取总RNA后，点样于尼龙膜上，与地高辛标记的HIF-1a基因探针杂交，结果与半定量RT-PCR结果比较。结果斑点杂交实验结果与RT-PCR结果一致，无统计学差异（P＞0.05）。结论用随机引物地高辛标记DNA探针可以快速筛查不同细胞株同一基因表达差异，可以作为研究肿瘤基因表达差异的工具。

地高辛；探针；肿瘤细胞；基因表达

（ChinJLabDiagn，2012，16：0204）

肿瘤的发生与发展的主要病因之一是癌基因的激活或抑癌基因的失活，目前临床开展的肿瘤标志物主要包括糖类、蛋白质类以及激素类，对基因类肿瘤标志物开展较少，因此，探讨和寻找基因类肿瘤标志物的检测方法已受到广泛关注［1，2］。缺氧是导致恶性实体肿瘤预后差的主要原因之一，缺氧诱导因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）是各种细胞对缺氧应答的一个重要转录因子，在多数肿瘤细胞中呈高表达［3，4］，本研究拟用地高辛标记 HIF-1acDNA探针，检测各类肿瘤细胞株中 HIF-1a mRNA表达水平，并与RT-PCR法比较，探讨斑点杂交方法筛选基因表达的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

各类肿瘤细胞株（乳腺癌 MCF-7细胞，宫颈癌HeLA细胞，卵巢癌SKVO3细胞，肝癌HepG2，人白血病细胞株K562细胞）由重庆医科大学组胚实验室和检验系实验室保存，地高辛随机引物标记试剂盒购自Roche公司，PCR相关试剂与RNA提取试剂Trizonl购自TaKaRA大连有限公司，引物参考 文 献 报 道 设 计［5］：HIF-1a：上 游 5′-CTCAAAGTCGGACAGCCTCA-3′，下游5′-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3′；β-actin，上游5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTCGACGATGGAGGG-3′，由TaKaRA大连有限公司合成。

1.2 各肿瘤细胞株的培养与缺氧处理

贴壁细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO2条件下常规培养至对数增长期，用胰酶消化后继续传代培养；悬浮肿瘤细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2条件下常规培养至对数增长期后传代继续培养。缺氧处理：将生长状态良好的各肿瘤细胞置于5%CO2下继续培养6h后，离心去上清后留沉淀加入Trizonl试剂提取总RNA。

1.3 DIG（地高辛）随机引物法标记HIF-1a﹑β-actin探针与标记效率的检测

按照Roche公司提供的说明进行，提取细胞总RNA后，逆转录成cDNA，逆转录反应条件为：42℃，30min；99℃，5min，加入 HIF-1a﹑β-actin特异性引物做PCR扩增与电泳，最后以胶回收的DNA作为作为随机引物法标记探针的摸板，将标记好的DNA探针在尼龙膜上，免疫显色后与阳性探针对比分析探针标记效率。

1.4 斑点杂交

分别取对数生长期的各组肿瘤细胞5×105个，分别提取总RNA后，用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，依次点在尼龙膜上，每株细胞点一个点，每个样本点量为2μg，同时每个样本设β-actin内参对照，每株细胞点一个点，每个样本点量为2μg，在120℃下干烤固定30min、杂交、免疫显色均按说明书进行。

1.5 肿瘤细胞株HIF-1a基因表达的RT-PCR检测

分别取对数生长期的各肿瘤细胞5×105个，采用Trizol试剂分别提取各组细胞的总RNA。逆转录反应条件为：42℃，30min；99℃，5min。PCR反应条件为：95℃2min，95℃35s，56℃35s，72℃50 s，30个循环，最后72℃延伸5min。同时以β-actin作为内参，最后取5.0μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（180v，20min）鉴定，采用凝胶图像分析仪分别测定每个样本HIF-1a和β-action条带的V值（Volume＝平均光密度值×条带面积），以DL，2000DNA Ladder测定分子量，算出各样本HIF-1a表达强度Rv＝V［目的基因］／Vβ-action。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 地高辛标记DNA探针的效率检测

与地高辛标记的标准DNA相比，HIF-1a基因探针可以检测到0.1pg的mRNA，用此种探针进行斑点杂交，灵敏度较高。如图1。

图1 地高辛标记HIF-1aDNA探针效率

2.2 斑点杂交结果

五种肿瘤细胞的RNA提取后，点样于尼龙膜上，用HIF-1a与β-action探针分别杂交后，每一样本重复实验三次，免疫显示如图2，Rv值如图3，乳腺癌 MCF-7细胞 HIF-1a表达的Rv值为0.935；宫颈癌HeLA细胞为0.874，卵巢癌SKVO3细胞为0.797；肝癌HepG2细胞为0.824；人白血病细胞株K562细胞为0.778。

图2 斑点杂交分析HIF-1a基因的表达

图3 RT-PCR分析 HIF-1a基因的表达

2.3 PCR检测结果

五种培养的肿瘤细胞分别提取RNA后，用HIF-1a特异性引物进行RT-PCR扩增，同时以βactin作为内参，最后取5.0μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（180v，20min）（图3），每一样本重复实验三次，图像显示灰度值，乳腺癌MCF-7细胞HIF-1a表达的Rv值为0.926；宫颈癌HeLA细胞为0.884，卵巢癌 SKVO3 细胞为 0.782；肝癌HepG2细胞为0.817；人白血病细胞株K562细胞为0.786。如图4。

2.4 斑点杂交与RT-PCR结果比较

将五种肿瘤细胞中HIF-1a基因表达分别用斑点杂交法与RT-PCR法检测，其定量值用Rv表示，用配对资料的t检验进行统计学分析，结果表明：斑点杂交实验结果与RT-PCR结果一致，无统计学差异（P＞0.05），如图4。

3 讨论

图4 用斑点杂交与RT-PCR检测各种肿瘤细胞HIF-1amRNA表达Rv值

缺氧诱导因子HIF-1是在缺氧条件下广泛存在于人和哺乳动物的异源二聚体转录因子，由HIF-1a和HIF-1β构成，HIF-1β在低氧环境和常氧环境下在细胞核均有表达，当环境氧浓度＞5%时，HIF-1a上的氧依赖降解区与E3泛醌连接酶结合通过泛素蛋白酶体途径将HIF-1a迅速降解，当细胞处于缺氧环境下时，阻碍了泛素蛋白酶对HIF-1a的降解作用致使细胞质内HIF-1a积聚增加，因此，HIF-1a是HIF-1的氧调节亚单位；HIF-1a的主要作用是肿瘤细胞在缺氧环境下诱导肿瘤相关基因过表达，其结果是促进肿瘤血管形成、细胞能量代谢旺盛、肿瘤转移能力加强。目前已有大量文献报道HIF-1a基因在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌等实体肿瘤中均过表达，并且与凋亡抑制蛋白等有良好的相关性，表明HIF-1a是肿瘤细胞在缺氧环境下恶性增殖与转移的主要原因之一，因此检测HIF-1a的表达有助于了解肿瘤细胞恶性增殖与转移情况［6］。

本研究通过提取细胞总RNA，经逆转成cDNA后，用HIF-1a特异性引物扩增该模板，胶回收扩增DNA片段，采用地高辛随机引物标记方法标记HIF-1a基因DNA探针，通过标记效率检测发现：该探针可以检测到样本中0.1pg的mRNA，说明标记效率与灵敏度都较高。此标记方法的优点是不需要将标记产物分离与纯化，操作非常简便，另外，由于标记的是DNA探针，因此标记好的探针可以回收后反复利用，有效避免了RNA探针容易降解的缺点。经过本实验表明：回收的探针用于分子杂交并不会影响实验的灵敏度与杂交背景。为了比较斑点杂交方法检测肿瘤细胞基因表达的可行性，本研究将五种培养的肿瘤细胞（乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLA细胞、卵巢癌SKV3细胞、肝癌HepG2细胞与人白血病细胞株K562细胞）分别提取RNA后，同时用RT-PCR方法与斑点杂交方法进行检测HIF-1amRNA的表达水平，结果显示两种检测基因表达的方法无统计学意义（P＞0.05），说明斑点杂交检测基因表达是可行的。此外，由于分子杂交方法的特异度明显高于基因扩增方法，所以分子杂交还可以检测基因突变等现象，可以有效筛选出肿瘤突变基因的存在。

本研究成功制备了地高辛标记的HIF-1a基因探针，建立了肿瘤细胞中显示基因表达差异的方法，为下一步研究HIF-1a基因的功能奠定了方法学基础。

［1］Dong Xu，Xu-fen Li，Shu Zheng，et al.Quantitative real-time RTPCR detection for CEA，CK20and CK19mRNA in peripheral blood of colorectal cancer patients［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2006，7：445.

［2］D R Emlet，R Schwartz，K A Brown，et al.HER2expression as a potential marker for response to therapy targeted to the EGFR［J］.Br J Cancer，2006，94：1144.

［3］Alexandros Daponte，Maria Ioannou，Ilias Mylonis.Prognostic significance of Hypoxia-Inducible Factor 1alpha（HIF-1alpha）expression in serous ovarian cancer：an immunohistochemical study［J］.BMC Cancer，2008，8：1186.

［4］Arno Kuijper，Petra van der Groep，Elsken van der Wall，et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha and itsdownstream targets in fibroepithelial tumors of the breast［J］.Breast Cancer Research，2005，7：808

［5］Jie Zhou，Tobias Schmid，Bernhard Bru，et al.Tumor Necrosis Factor－－Causes Accumulation of a Ubiquitinated Form of Hypoxia Inducible Factor-1through a Nuclear FactorB– Dependent Pathway［J］.Molecular Biology of the Cell，2003，14：2216.

［6］程艳香，江敬红，洛若愚.HIF-1a及其靶基因在宫颈癌组织中的表达［J］.实用癌症杂志，2009，24：245.

Detection of gene expression difference in tumor cell lines rapidly with DNA probe-labeled by Digoxin

WANGYongqiang，YINYun-zhong，LIChuan-da，etal.（TheSecongHospitalofNeijiangCity／TheAffiliatedNeijiangHospital，LuzhouMedicalUniversity，Neijiang641100，China）

ObjectiveTo estabilish dot blot hybridization technology in the detection of HIF-1agene expression of various tumor cells and to explore the availability of dot blot in screening gene expression difference.MethodsNuclear acid were extracted from a variety of cultured tumor cell lines and spotted on the nylon membrane，dot blot analysis and semi-quantitative RT-PCR were carded out respectively to detect HIF-1agene expression.ResultsThe dot-blot hybridization results are consistent with the RT-PCR.it did not reach the conventional level of statistical significance（P＞0.05）.ConclusionDot blot hybridization with DIG-labeled HIF-1aprobe can be used to screen quickly gene expressing difference in tumor cells and serve as a research tool for tumor gene expression difference.

Digoxin；probe；tumor cells；gene expression

Q786 R730.2

A

1007－4287（2012）02－0204－03

吴阶平医学基金（FWMN-2011L007）

汪永强（1978－），男，检验师，硕士研究生，主要从事临床检验诊断学分子诊断方向研究与工作。

2010－05－24）