荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用

杨渝伟 薛冰蓉 陈小红 俸家富

四川省绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积累为特征的肿瘤，约占血液肿瘤的10%。染色体异常在该病中有极高的发生率且有独立的预后判断价值，但是传统细胞遗传学方法检测到染色体异常率只占初诊患者的1/3左右。荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术能对间期细胞进行分析，克服传统方法的缺陷，大大提高核型异常检出率。本研究应用该技术检测39例MM初诊患者，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年6 月～ 2009 年9月四川省绵阳市中心医院MM初诊患者39例，其中男24例，女15例，年龄36～80岁，中位年龄61.5岁。诊断标准依据中国多发性骨髓瘤工作组发布的《中国多发性骨髓瘤诊治指南》（2008版）[1]。ISS分期Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例；DS分期Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例；免疫球蛋白类型IgG型19例，IgA型10例，轻链型7例，不分泌型3例。对照组15例为非血液系统恶性疾病患者，其中男9例，女6例，年龄26～65岁，中位年龄57.5岁。

1.2 探针

多发性骨髓瘤FISH检测试剂盒购自北京金菩嘉生物有限公司，内含针对1q21区带的序列特异性探针1q21、针对13q14区带的序列特异性探针RBl（视网膜神经胶质瘤基因）和D13S319、针对14q32区带的序列特异性探针IGH和针对17p13区带的特异性探针p53。标记探针-20℃保存备用。

1.3 标本的处理

选取新鲜骨髓涂片（涂片均匀、勿厚）晾干后，56℃烤片10～20 min，100%甲醇浸泡5 min，100%乙酸浸泡30 min，室温2xSSC液洗片2次各5 min，56℃老化玻片30～60 min或室温下过夜老化玻片。老化好的玻片先后置37℃新鲜配制的RNase A溶液和盐酸胃酶溶液中分别孵育30 min和10 min，2xSSC溶液洗片2次各5 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脱水各2 min，晾干后加热至56℃，进行杂交试验。

1.4 原位杂交

在暗室按照检测试剂盒操作说明配制探针，73℃70%甲酰胺变性6 min，置45～50℃环境中备用。老化好的玻片置73℃70%甲酰胺中变性6 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脱水各3 min，晾干，置45～50℃烤片机上预热2～5 min，将10μL变性后的探针滴加于杂交区域，加盖盖玻片（避免产生气泡），42℃密封过夜。杂交后的玻片依次置于46℃50%（v/v）甲酰胺/2x SSC溶液和2x SSC溶液中洗涤，室温70%乙醇浸泡3 min。晾干后，DAPI复染15 min，封片。

1.5 结果观察

荧光显微镜下观察，通过Imstar FISH软件控制的CCD（ProgRes MFcool）摄取图像，每例分析100～200个间期细胞核。IGH探针正常显示2个红色和绿色融合的黄色荧光杂交信号，出现分离的红色或绿色荧光杂交信号为IGH重排；RBl、D13S319、p53和lq21探针正常均显示2个红色或绿色杂交信号，无或仅有1个杂交信号为该探针缺失，具有3个及以上杂交信号的则为该探针扩增。

1.6 结果判断

以15例非血液系统恶性疾病患者为对照组，计算各探针阳性细胞表达率的均值（x）和标准差（SD），并以x+3SD为阳性阈值。对于MM患者，其FISH检测的阳性细胞表达率大于阈值判定为阳性结果，小于阈值判定为阴性结果。

1.7 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件对样本率进行x2检验和Spearman相关系数分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各探针阳性阈值的建立

对15例非血液系统恶性疾病患者的骨髓样本，每例分析100～200个间期核细胞，得到各探针阳性细胞表达率，计算均值（x）和标准差（SD），以x+3SD为阳性阈值。见表1。

表1 各染色体探针杂交信号阳性阈值

2.2 39例MM患者探针异常表达分析

39例MM患者应用5种探针的检测情况如图1，A-C所示。各探针异常表达情况分析结果（表2）显示，1q21扩增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的检出例数（率）分别为 24例（61.5%）、15例（38.5%）、18例（46.2%）、8例（20.5%）和13例（33.3%）。总共31例（79.5%）存在染色体异常，23例（59.0%）存在至少两处染色体异常。Spearman相关性分析发现，lq21扩增与p53缺失呈显著性正相关（r=0.359，P=0.035）；RB1和D13S319同时缺失15例，呈显著性正相关（r=0.854，P=0.000）。

表2 39例MM患者5种探针异常表达情况分析

图1 5种探针的检测情况

2.3 染色体异常与分型、分期情况

染色体异常与分型、分期的情况见表3。结果显示：除IGH重排与DS分期之间（r=0.434，P=0.007）、p53缺失与IIS分期之间（r=-0.448，P=0.006）和D13S319缺失与免疫学分型之间（r=-0.335，P=0.040）呈显著相关性外，其余染色体异常与D-S分期、IIS分期和免疫学分型均无相关性。

3 讨论

早期对MM细胞的细胞遗传学和分子细胞遗传学研究表明，几乎所有的MM都存在克隆性染色体异常，且多为复杂核型异常，其中最为常见的是1、13、14和17号染色体结构或数目异常。本研究选用lq21、RBl、D13S319、p53和IGH共5种特异性探针检测异常表达率较高的1q2l扩增、13q14缺失、17p13缺失以及14q32易位。

研究结果显示，MM患者1q21扩增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的检出率分别为61.5%、38.5%、46.2%、20.5%和33.3%，其中发生率最高的是1q21扩增，其次是D13S319缺失。79.5%患者均存在染色体异常，其中复杂核型异常占59.0%。由于常规显带只有约1/3的患者检测结果为阳性[2]，因此FISH技术相比传统检测方法，明显提高了核型异常的检出率，并证实MM的核型异常多为复杂核型异常。

表3 染色体核型异常与分型、分期之间关系[n（%）]

1q21区域存在与MM患者紧密相关的基因簇，其中包括IL-6受体基因，MM患者在受累的IL-6基因作用下，致使IL-6受体数目基因量效性增加，促进骨髓中浆细胞增殖分泌大量β2-MG，预后差、生存期短[3]。此外，CKSlB基因亦位于lq21区域，属于Cks/Sucl蛋白家族，能通过Skp2和p27K-依赖和非依赖机制促进MM瘤细胞的增殖，是MM预后不良因子[4-5]。研究显示1q21扩增的发生率为61.5%，高于国外研究结果，但与国内报道相符[6-7]，说明中国人群MM患者lq21扩增比例较高。

RB1（13q14）和D13S319（13q14.3）是检测13q14缺失的两个主要部位。13q14缺失在MM发病机制中起重要作用，同时也是预示生存期短的重要指标，尤其是合并血清β2-MG升高者[8-9]。结果显示，13q14缺失的发生率为46.2%，但是13q14缺失与1q21扩增之间无相关性（r=0.309，P=0.098），与文献报道不符，有待于进一步扩大病例数来得出更精确的结论。

p53缺失并非MM特有的异常。研究结果显示，p53缺失在MM患者中的发生率为20.5%，在IIS分期中存在显著性差异（x2=7.169，P=0.021），且与IIS分期呈显著性负相关（r=-0.448，P=0.006），说明17p13缺失是疾病过程中较少的继发事件，且多发生在III期。Spearman相关性研究显示，p53缺失与lq21扩增呈显著正相关（r=0.359，P=0.035），结果支持近来国外研究报道：17p13缺失与1q21扩增共同参与激活血管新生级联反应，使骨髓微环境中的微循环血量增加，可能是导致MM发病的重要机制[10]。

14q32易位的发生率为33.3%，略低于相关的文献报道。14q32 易位机制较为复杂，包括 t（11；14）（q13；q32），t（4；14）（p16.3；q32.3），t（14；18）（q32.3；q21.3）等，主要涉及编码免疫球蛋白重链（IGH）的重链基因[11]，FISH结果均表现为两个分离的红/绿杂交信号。大量实验证实存在t（11；14）患者预后稍好，伴有t（4；14）的患者预后较差。IGH探针虽然能够发现14q32易位，却不能表明与哪条染色体进行了易位重排，其预后价值有待进一步证实。对MM分期研究结果显示，IGH重排在疾病分期中有显著性差异，且与D-S分期呈显著性正相关（r=0.434，P=0.007）。在所研究的5种染色体探针中，D-S分期I期的MM患者有3/7例仅表达出IGH重排异常。这些结果均说明IGH重排是MM染色体异常的一个早期事件。

综合上述，lq21扩增、13q14缺失、p53缺失及IGH重排是MM常见的核型异常，前三者是MM发展及预后的不良因素。FISH技术是检测分子遗传学异常高度敏感的方法，应当作为评估MM常规检查。

[1]中国多发性骨髓瘤研究组.中国多发性骨髓瘤诊治指南[J].中华内科杂志，2008，47（10）：869-872.

[2]罗绍凯，苏畅，王晓桃，等.102例多发性骨髓瘤临床资料分析[J].临床血液学杂志，2008，21（3）：115-116.

[3]Shaughnessy J，Zhan F，Burington B，et a1.A validated gene expression model of hIGH-risk multiple myeloma is defined by disregulated expression of genes mapping chromosome 1[J].Blood，2007，109（6）：2276-2284.

[4]Zhan F，Colla S，Wu X，et a1.CKSlB，overexpressed in aggressive disease，regulates multiple myeloma growth and survival through SKP2-and p27Kipl-dependent andindependent mechanisms[J].Blood，2007，109（11）：4995-5001.

[5]Shaughnessy J.Amplification and overexpression of CKS1B at chromosome band lq21 is associated with reduced levels of p27 and an aggressive clinical course in multiple myeloma[J].Hematology，2005，10（suppl 1）：117-126.

[6]Chng WJ，Van Wier SA，Ahmann GJ，et al. A validated FISH trisomy index demonstrates the hyperdiploid and nonhyperdiploid dichotomy in MGUS[J].Blood，2005，106（6）：2156-2161.

[7]杨瑞芳，李春溟，陈丽娟，等.荧光原位杂交技术检测MM分子遗传学改变及其意义[J].中华医学遗传学杂志，2010，27（5）：567-570.

[8]Saughnessy J，Tian E，Sawyer J，et a1.High incidence of chromosome 13 deletion in multiple myeloma detected by multiprobe interphase FISH[J].Blood，2000，96（4）：1505．

[9]Facon T，Aver-Leiseau H，Guillerm G，et a1.Chromosome 13 abnormaliies identified by FISH analysis and serum β2-microglobulin produce a powerful myeloma staging system for patients receiving hIGH-dose therapy[J].Blood，2001，97（6）：1561-1577.

[10]Jens H，Christian MZ，Andreas N，et a1.Gain of lq21 and distinct adverse cytogenetic abnormalities correlate with increased microcirculation in multiple myeloma[J].Int J Cancer，2008，122（12）：2871-2875.

[11]王志敏，丛雅琴，马立宁，等.Cyr61和VEGF在慢性髓细胞白血病中的表达及相关性探讨[J].临床血液学杂志，2009，22（7）：354-356.