食用油DNA提取及检测技术的研究进展

何 景，许文涛，2，黄昆仑，2，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083;2.农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)，北京，100083)

食用油DNA提取及检测技术的研究进展

何 景1，许文涛1，2，黄昆仑1，2，*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083;2.农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心(北京)，北京，100083)

对食用油DNA提取方法、样品基质和食用油加工工艺对食用油DNA提取的影响进行了系统阐述;综述了检测基因、分光光度法、荧光光谱法、定性PCR、实时定量PCR和分子标记技术在食用油DNA检测中的应用现状;讨论了食用油DNA提取和检测中存在的问题及未来的发展前景。

食用油，DNA提取方法，样品基质，加工工艺，检测技术

Abstract:The influences of DNA extraction method，sample matrix and edible oil processing on DNA extraction from edible oil were systematically illustrated.The application progress of chosengene of detection，spectrophotometry，fluorescence spectroscopy，qualitative PCR，real time PCR and molecular markers were reviewd.And the present problems and development prospects of DNA extraction from edible oil and detection technique were discussed.

Key words:edible oil;DNA extraction method;sample matrix;processing;detection technique

现在市场上的精炼植物油主要有大豆油、玉米油、花生油、葵花油、橄榄油、菜籽油和芝麻油等及其调和油，其主要成分为甘油三酸脂，提供了人体自身无法合成的必需脂肪酸，如亚油酸、α-亚麻酸等，及各种脂溶性维生素A、D、E、K等。各种食用油的营养价值不同，其中以橄榄油最佳，其不饱和脂肪酸高达82%～87%，油酸、亚油酸、亚麻油酸含量的比例是最适合人体需要的比例［1］。随着科技的进步和人们健康意识的增强，人们更加关注食品的质量和安全。转基因的检测是人们对于食品质量与安全关注的重点之一，最主要的转基因作物是大豆，2010年大豆的种植面积占全世界油料作物种植面积的58%［2］。大豆油是主要的食用油之一，在美国大豆提供的食用油脂占所有油脂的68%［2］，中国转基因大豆进口量逐年增加，目前中国市场上70%的大豆制品含有转基因成分［3］;另外，人们在食用油方面关注的问题是食用油掺假问题，由于不同食用油营养价值不同，价格差异很大，有些不法厂商为了追逐高利润，向高价食用油中添加低价食用油，严重损害了消费者的利益。最常用检测转基因的方法是基于DNA的检测技术(如PCR)，基于蛋白质的检测技术并不适用于分析检测深加工食品。食用油掺假检测主要有理化检测方法、气相色谱法、近红外光谱技术、高效液相色谱法及同位素比值法［3］或质子转移反应质谱(PTR-MS)、核磁共振光谱(NMR)［4］等方法。虽然每种食用油化学组成不同，但化学分析方法分析食用油的起源和真实性并没有固定的指标，且其检测限不够低(≥5%)［4-5］，所以化学分析方法并不能满足食用油真实性的检测。基于DNA的检测技术检测线高且能更好的反应原料的真实性，所以分子手段更适合食用油掺假的检测，近几年，应用分子手段检测食用油掺假问题的研究主要在橄榄油方面［6］。本文对食用油DNA提取及检测技术进行了详细综述。

1 食用油DNA的提取方法及其主要影响因素

1.1 DNA提取方法

目前，关于食用油DNA提取方法的研究有很多，其中橄榄油研究的比较多，其次是大豆油，其他植物食用油研究的比较少。应用于食用油的DNA提取的方法有很多种，主要有试剂盒法、乳化法和冷冻干燥法。

DNA提取的第一步是样品的制备，提取食用油DNA有两种样品制备方法，一是食用油直接作为样品，如果是市售食用油可以直接作为样品，因为其已经是具有代表性的均一样品;如果是实验室自制食用油或者食用油半成品则需要先把整个样品振荡混匀，再取适量用于DNA提取。另一种是先离心食用油，以得到的沉淀为样品，但市售食用油已经过离心等加工过程，所以离心几乎不能从市售食用油中得到沉淀。

1.1.1 试剂盒法 通过对试剂盒提取食用油DNA的比较研究，得出比较好的食用油DNA提取试剂盒有the Qiagen QIAamp DNA stool extraction kit［7-8］、the Nucleospin food kit［9］、the Promega Wizard DPSF Kit［10-11］，其采用的方法分别是树脂法、离心柱法和磁珠法。试剂盒法直接以液态食用油为样品。

1.1.2 乳化法 目前乳化法提取食用油DNA的研究很多，但目前为止并没有固定公认的最佳的食用油DNA提取乳化法，且常常造成假阴性的结果。乳化法分为两类，一类是有机试剂法，另一类是直接提取液法。有机试剂法直接以食用油为样品，选择的有机试剂主要是正己烷，但Bogani等在提取脱胶大豆油DNA时选择的有机试剂是氯仿(代替了正己烷)［12］;Li等在提取含有棕榈油的混合食用油DNA时有机试剂选择的是石油［13］;Doveri等在提取实验室自制橄榄油DNA时选择的有机试剂是正庚烷［8］。此外，虽然在很多研究中食用油DNA提取都使用有机试剂，但Testolin等［14］以橄榄油为样品对有机试剂法进行优化实验，结果显示有机试剂正己烷并没有提高DNA提取率。直接提取液法的样品有两种，一种是离心食用油后得到的沉淀，另一种液态食用油。相对于有机试剂法，直接提取液法研究的比较少，且精炼食用油离心后得不到沉淀，但 Costa［15-16］等用Wizard、CTAB和 Nucleospin提取精炼食用油 DNA时，采用了预先离心(18，5149 × g，30min，4℃)食用油取沉淀为样品的方法;Busconi［17］等提取特级初榨橄榄油时也预先离心(14000×g，30min，4℃)橄榄油取沉淀为样品。Torre［18］等提取自制的橄榄油 DNA时，直接磁力搅拌自制橄榄油和TEA，且可以从1g橄榄油中提取到0.1～0.5pg的DNA。所以乳化法提取食用油DNA还有待进一步研究。

乳化法中，沉淀时添加核酸助沉剂有助于提高DNA的提取率，目前核酸助沉剂市售和文献报道的有五种［19］，市售的核酸助沉剂有三种:核酸助沉剂Acryl Carrier，核酸助沉剂Glycogen，核酸助沉剂酵母tRNA;文献报道的是其他物种的DNA［20］和聚丙烯酰胺溶液［21-22］。氯仿/异戊醇或者酚/氯仿/异戊醇抽提对于食用油DNA纯化是必要的步骤［4］，有些研究中采用试剂盒提取食用油DNA时也会增加酚氯仿抽提步骤［23］。试剂盒［24］纯化食用油 DNA 可以提高DNA的纯度，但DNA的含量也会随着丢失，所以试剂盒纯化提取率对食用油DNA提取很重要。

1.1.3 冷冻干燥法 冷冻干燥法［22］是白立群等提取精炼大豆油DNA时提出的一种新型食用油DNA提取方法，其主要优点是将大量含有DNA的溶液浓缩，减少了工作量，且成功检测出精炼大豆油DNA中的大豆内源Lectin基因，CaMV35S启动子和NOS终止子。

1.2 样品基质对食用油DNA提取的影响

不同食用油的DNA提取效率不同。制取食用油的原料、原料处理、加工工艺和食用油储存条件以及储存时间长短都会导致食用油中DNA残留量不同。玉米胚芽油的原料是在制玉米糁和玉米淀粉过程中回收的玉米胚芽，橄榄油的原料是油橄榄鲜果直接压榨，大豆和花生油的原料都是完整的种子;食用油生产工艺有很多种，主要分为压榨和浸出两种，压榨又分为冷榨和热榨，Busconi［17］等研究从初榨橄榄油提取DNA中，提出采用冷压榨技术生产的橄榄油(不包括离心和过滤步骤)更有利于DNA提取，且提取的DNA更有利于PCR等检测技术的应用。不同的食用油成分不同，如脂肪酸的饱和度、蛋白含量、游离脂肪酸和色素等都可能影响食用油DNA提取;同种食用油，不同品牌、不同生产批次、采用的原料产地、新鲜度和生产工艺及工艺参数等不同都将导致食用油组成有所差别，如葵花籽油中脂肪酸的构成因气候条件的影响，寒冷地区生产的葵花籽油含油酸15%，亚油酸70%左右;温暖地区生产的葵花籽油含油酸65%左右，亚油酸20%左右［25］，都有可能影响食用油DNA提取。王亚［26］在食用油DNA提取方法的研究结果表明，油菜籽油的DNA产物浓度相对较高，其次是大豆油、棉籽油，玉米油的产率最低;Wu［8］等用 Water-lineal polyacrymide 方法提取四种品牌的大豆油时，只成功从其中三种品牌的大豆油中提取出可扩增的DNA，且这三种品牌的大豆油的DNA提取率也各不相同。食用油的品质和储存中的很多因素有关，如温度、光照和氧含量等，这些因素都会加速食用油氧化;且食用油本身含有的脂肪酸的组成也影响着食用油的氧化程度，含有大量饱和脂肪酸的比较稳定，含有大量不饱和脂肪酸的容易氧化。Pafundo［23］等在橄榄油储存时间对AFLP(Amplified Fragments Length Polymorphisms)技术评价橄榄油DNA的影响的研究表明，采用分子手段鉴定橄榄油应该在橄榄油一个月的储存期内，如果超出一个月，从橄榄油中提取的DNA质量显著下降;Spaniolas［27］等研究结果也表明，随着食用油储存时间的延长，DNA降解的越严重，且提取的DNA溶液的PCR抑制效应也越大。

1.3 食用油加工步骤对食用油DNA提取的影响

市售的植物食用油主要有压榨食用油和浸出食用油。压榨油加工工艺是“物理压榨法”，其要求原料精选，油料经去杂、去石后进行破碎、蒸炒、挤压，让油脂从油料中分离出来，得到粗油。精炼过程主要有沉降、脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱蜡和脱致癌物等［28］。

食用油精炼过程会严重降解去除粗油中的DNA。针对食用油精炼过程对DNA提取和检测的影响的研究主要有大豆油。食用油精炼过程第一步为离心或者其他分离方法(如过滤)，除去油中不溶性杂质(细胞或组织)，绝大部分DNA在这一步随着沉淀被分离除去，食用油中仅残留下微量的 DNA。1998 年，Pauli［29］等研究表明，对大豆粗油离心几乎可以完全除去其中的 DNA，巢式 PCR扩增结果为阴性。

脱胶主要是将粗油中的胶溶性杂质(主要是磷脂和部分蛋白质)脱除的工艺过程，是向粗油中加入热水或通水蒸气，加热脂肪并在50℃温度下搅拌混合，然后静置分层，分离水相［28］。脱胶将使食用油中微量DNA再次随着极性水在高温下大量丢失，给食用油DNA提取带来巨大挑战。Gryson［30］等可以从离心后的大豆粗油提取到大豆Lectin基因，但检测不到脱胶油中的DNA，说明脱胶是去除粗油中DNA的重要一步;Gryson［31］等加大了样品用量，从250g磷含量72.4ppm的脱胶大豆油中PCR扩增出Lectin基因，从365g磷含量32.0ppm的脱胶大豆油中PCR扩增出Lectin基因。综上所述，虽然离心和脱胶是除去粗油中大量DNA的重要步骤，但还是有可能提取得到 DNA，并可成功应用于 PCR扩增。Bogani［11］等从5mL脱胶大豆油中提取得到1.7ng大豆DNA，并成功检测到了Lectin基因、外源CP4基因、35s启动子基因、转化事件特异性基因。

除了脱胶过程，脱酸过程也是油水分离过程，其是向油相中加入碱溶液和游离脂肪酸，然后油水分离，油水分离后，再用热水洗涤中性油，静置离心，分离除去残留的皂脚。其他精炼过程，脱色、脱臭、脱蜡或脱致癌物，都会不同程度的降解去除食用油中的DNA。

2 食用油DNA检测技术

2.1 检测基因的选择

分子技术应用于食用油的检测主要有三个方向:转基因方面，食用油掺假方面和鉴定食用油原料品种方面。研究食用油是否含有转基因成分主要针对大豆油，检测基因主要有35S、NOS、CP4-EPSPS及其物种转化事件特异性基因。食用油掺假涉及每种食用油，检测的基因是各自的物种特异性基因。鉴定食用油原料品种主要针对橄榄油，应用的分子标记技术主要有SSR、SNP、RAPD、SCAR和AFLP等。

检测食用油DNA质量的基因主要有叶绿体ATP［6，32］、RBCL［32］基因和物种特异性基因。叶绿体基因在多数植物中以多拷贝形式存在，所以对于DNA含量甚微的精炼食用油，比单拷贝或少拷贝的物种特异性基因，具有更高灵敏度的优势。由于5S基因拷贝数高(几千拷贝/单倍体)，且在植物物种之间是很保守的区域，Doveri等［33］提出5S基因结合了叶绿体基因高拷贝和内标基因特异性的特点，是更理想的鉴定食品中物种成分的基因，且设计了扩增大豆、葵花、玉米和油菜的5S基因的物种特异性引物。

扩增片段大小和扩增基因组成对PCR扩增精炼食用油DNA很重要。扩增片段越小，PCR扩增成功率越高［34］，且GC含量高的DNA在加工工程中更稳定，内源基因比外源基因在加工过程中更稳定［35］。所以PCR扩增食用油DNA应该选择片段小且GC含量高的基因组片段，转基因成分精确定量应慎重选择扩增基因及其扩增片段。

2.2 食用油DNA检测技术

食用油DNA的检测分析技术主要有凝胶电泳、分光光度法、定性PCR、实时荧光定量PCR(检测片段大小不同)和分子标记技术，其中分子标记技术主要用于橄榄油品种鉴定，Agrimonti［36］详细综述了分子标记技术在橄榄油中的应用。其中凝胶电泳并不适合评价精炼食用油DNA，因为精炼食用油DNA降解特别严重，凝胶电泳检测不出精炼食用油DNA，只适合评价非精炼食用油DNA。

2.2.1 分光光度法和荧光光谱法 分光光度法和荧光光谱法可以快速确定溶液中的DNA浓度，所以可以用来比较不同食用油DNA提取方法的提取效率。分光光度法通过测定波长在260nm处的紫外吸收值确定DNA浓度，其操作简便、成本低，但其结果很容易受到溶液中其他物质的影响(如酚、乙醇、RNA等)，所以其不能准确反映溶液中的DNA浓度，只适合高纯度dsDNA的定量。在DNA浓度测定之前，应该漩涡振荡DNA溶液使DNA分布均匀。分光光度法也可以测定DNA溶液的纯度(A260/A230和A260/A280)。但在一些研究［14］中，采用向 DNA 溶液中添加一定数量的纯度和质量都很好的DNA原液，然后通过PCR扩增的方法，比较 DNA溶液和DNA原液的PCR扩增条带来反映是否存在有PCR抑制物，如果DNA溶液的PCR条带比DNA原液的PCR条带暗，说明DNA溶液中PCR抑制物存在，反则说明DNA溶液中没有PCR抑制物存在。

与分光光度法相比，荧光光谱法应用染料(如PicoGreen、Hoechst和SYBRGreen等)和双链DNA相结合后荧光信号增强，以DNA标准样品建立标准曲线后计算出样品DNA的浓度，其检测灵敏度高于分光光度法，也能一定程度上反映DNA的裂解程度，但其也受很多因素的影响，如模板AT含量、pH、盐浓度和有机试剂等［35］。Ayed［7］等成功应用HoechstH33258染料测定橄榄油DNA浓度，测定的浓度范围为 5～10ng/μL。但 Costa［15］等研究中发现，Picogreen测定DNA浓度的试剂盒并不适合测定大豆油DNA的浓度。所以荧光光谱法测定DNA浓度并不能广泛用于食用油DNA浓度测定。

2.2.2 定性PCR 定性PCR是基于DNA检测法中的最常用的方法。定性PCR可以检测提取的食用油DNA质量或者确定每个食用油加工步骤对食用油DNA的影响程度。在PCR检测DNA质量时，目标基因的选择是非常重要的。如果采用高拷贝数的目标基因，如叶绿体基因，PCR检测灵敏度会更高，但物种组织之间叶绿体基因拷贝数不同，食用油叶绿体基因残留量也就不同。所以目标基因应慎重选择，可以根据实验目的而选择合适的目的基因。

评价加工步骤对DNA质量的影响程度可以采用定性PCR扩增不同片段大小的相同基因的方法。DNA降解越严重，残留DNA的片段越小，残留的大片断DNA也就越少，所以PCR扩增小片段DNA的成功率高于PCR扩增大片段的成功率，从而评价DNA的不同降解程度。此外，很多研究应用定性PCR和毛细管凝胶电泳结合来评价食用油DNA质量［7，14，37-38］。

定性PCR虽然很灵敏，但其需要凝胶电泳使其扩增片段可见，其整个检测分析时间长(和荧光定量PCR相比)、分辨率低、整个分析系统不能自动化、污染的可能性比定量PCR高，且凝胶电泳中使用有毒试剂(EB等)使扩增片段可见。此外当其DNA模板中DNA含量差别不够大时，PCR扩增条带的亮度没有差别，所以定性PCR并不是评价食用油DNA质量的理想方法。

2.2.3 实时荧光定量PCR 目前主要有两种类型的荧光定量PCR方法:竞争性荧光定量PCR和实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR是目前国际上转基因作物及其产品定量检测中使用最广的方法。实时荧光定量PCR被认为是准确、特异、无交叉污染和高通量的定量PCR方法，其原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR的最低检测线可以达到pg 级［39］。

实时定量PCR有很多优点，如高灵敏性、特异性强、结果重复性好、模板拷贝数范围广。与定性PCR相比，定量PCR不需要后续处理，PCR后交叉污染低。和竞争性荧光定量 PCR相比，其更灵敏，更准确。

荧光定量PCR可以用来评价食用油加工工艺对食用油DNA的影响或食用油DNA提取方法的提取效率［6］。由于定量PCR的灵敏度更高，所以其比定性PCR更适合评价食用油DNA。当定量食用油转基因成分或者其他基因成分时，转基因基因或者其他基因的目标片段大小和对照基因的目标片段大小应该尽量一致，以保证两者扩增效率相近。由于食用油DNA含量少，实时荧光定量PCR的实验设计以及实验材料选择应该特别小心［40］。

3 展望

目前，食用油DNA提取方法各式各样。试剂盒法，操作简单，且能流水线运作，适合大量样品的检测。但其成本高，提取的量较少，目前最常用于提取食用油DNA的试剂盒是Qiagen QIAamp DNA stool，但在研究中其只被用于提取橄榄油DNA，由于橄榄油DNA提取易于其他精炼食用油DNA提取，所以其是否适合其他食用油DNA提取还有待进一步研究。乳化法，步骤简单、成本低、也是有效的食用油DNA提取方法，且能适当增加或减少样品的用量，但目前乳化法各式各样，有待确定最佳的适合食用油DNA提取的乳化法。

食用油DNA提取研究最多的是橄榄油，其次是大豆油，其他食用油DNA提取研究的很少，且由于每种食用油原料不同，生产工艺不同，组成不同，储存条件及时间不同，DNA残留量也不同，导致每种食用油最佳DNA提取方法不同或提取效率不同，所以有待针对每种食用油DNA提取做系统的研究，确定适合于食用油DNA提取的通用方法或者每种食用油DNA提取的最佳DNA提取方法。

分子技术用于食用油方面主要有三个研究方向:转基因方面，食用油掺假方面和鉴定食用油原料品种方面，随着这些问题的出现，食用油快速检测技术也是食用油分子检测技术的热点之一。食用油DNA检测技术最常用的是分光光度法、定性PCR、实时荧光定量PCR和分子标记技术，用于检测食用油DNA质量、各个因素对食用油DNA提取的影响;由于食用油DNA含量低，所以食用油DNA纯度低极易导致假阴性的结果，酚氯仿抽提可以满足去除食用油DNA中PCR抑制物的要求，但操作应该特别小心，避免酚残留及乙醇残留，否则导致PCR假阴性结果。定性PCR、实时荧光定量PCR是研究转基因和食用油掺假的有效方法，由于食用油DNA被严重降解，DNA片段相对较小，所以扩增片段大小严重影响着扩增成功率，当扩增片段过大时，则会导致PCR扩增失败。目前，应用于食用油DNA检测的分子技术还有多重 PCR［5］、毛细管电泳［7，14，37-38］、生物传感器［11］和高效液相色谱法［26］。

食用油DNA残留量少是制约PCR检测的重要因素之一，其可以通过高灵敏度的分子检测技术克服。目前，高灵敏度的分子检测技术有巢式PCR，环介导等温PCR和纳米PCR等，巢式PCR比普通PCR法的检测线高3～6个数量级［40］，但由于其扩增两次，很容易由于交叉污染导致假阴性的结果，现在有单管巢式PCR法可以克服这个困难，其利用引物的不同退火温度来实现同一管中两对引物不同时间扩增;环介导等温PCR(LAMP)检测线为0.005%，比普通PCR法高2～5个数量级，其所需时间短，不需要特殊仪器，不需要后续琼脂糖凝胶电泳等操作，有利于快速食用油DNA检测［41］。纳米PCR(NP-PCR)虽然主要是提高PCR扩增特异性，但其也具有高灵敏度的特点。

食用油DNA转基因成分或者掺假成分的精准定量现在鲜有研究，食用油DNA含量少且质量差是食用油DNA精准定量面对的难题之一。由于食品油加工工艺，DNA降解严重，且转基因成分比内源基因破坏的比较严重，将导致转基因成分过低评价［35］，所以食用油DNA转基因成分或者掺假成分的精准定量还有待进一步研究。Noutsias提出TaqMan预扩增技术，其可以提高实时荧光定量PCR的灵敏度和准确度，Gaudio等应用该技术于检测食品中的大豆和玉米成分［42］。

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Research progress of DNA extraction and detection technique for edible oil

HE Jing1，XU Wen-tao1，2，HUANG Kun-lun1，2，*
(1.College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.The Supervision，Inspection＆ Testing Center of Genetically Modified Food Safety，Ministry of Agriculture，Beijing 100083，China)

TS221

A

1002-0306(2012)12-0382-06

2011-08-16 *通讯联系人

何景(1986-)，女，硕士研究生，研究方向:食品安全。

国家高技术研究发展计划(863)项目(2006AA10Z440);国家自然基金(30800770);转基因生物重大专项(2008ZX08012-001)。