激肽释放酶-激肽系统在缺血损伤后血管新生中的作用研究进展

傅聪，姚玉宇

(东南大学医学院心血管病研究所;东南大学附属中大医院心血管内科，江苏南京 210009)

1930年Kraut等［1］在胰腺中发现了一种可以使血压下降的高浓度物质，并命名为激肽释放酶。随着研究的进一步深入，发现激肽释放酶-激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)是由一系列的血管活性肽和多种酶组成，并在血液和组织中发挥重要功能，包括减轻心脏和肾脏的损伤，抑制再狭窄和缺血性卒中，促进缺血心脏和下肢的血管新生和组织损伤修复，降低血压，参与凝血过程等［2］。此外，组织中的激肽释放酶还能起到抗炎症、抑制凋亡和纤维化，促进皮肤损伤的修复［2］。激肽释放酶-激肽系统在心血管疾病中的作用正受到越来越多的关注。作者对激肽释放酶-激肽系统在血管新生中的作用作一综述。

1 激肽释放酶-激肽系统的组成

激肽释放酶-激肽系统主要由激肽原、激肽释放酶(Kallikrein，KLK)和激肽组成。激肽原分为高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)和低分子量激肽原(low molecularweight kininogen，LMWK)。KLK包括两类，血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶，分别由前激肽释放酶和激肽释放酶原转换而来。激肽家族包括缓激肽(bradykinin，BK)、赖氨酰缓激肽、甲硫氨酰赖氨酰缓激肽。在激肽释放酶-激肽系统中，BK和赖安酰缓激肽是最重要的两种物质。它们由激肽原经KLK作用转换而来，其中赖安酰缓激肽又可被血液及尿液中的氨基肽酶降解为缓激肽。激肽可被多种酶降解，如激肽酶Ⅰ和激肽酶Ⅱ，激肽酶Ⅱ即血管紧张素转化酶。这些酶将激肽降解为一些代谢产物和无活性片段。

激肽有B1和B2两种受体，完整的激肽与B2受体结合，经降解的激肽代谢产物与B1受体结合发挥作用。B2受体在组织中表达水平无明显变化，而B1受体为可诱导型受体，正常状态下表达水平很低。在应激和炎症条件下其表达会上调［3］。经激肽酶Ⅰ将C端的精氨酸降解后的缓激肽和赖安酰缓激肽是B1受体敏感的激动剂［4］。

2 血管新生的基本过程

血管新生即从现有的脉管系统中长出新的血管。内皮细胞从基膜脱落并迁移到血管周间隙发生增殖，新的内皮细胞形成管腔样结构，并进一步形成新生的血管。针对血管新生的治疗方法是治疗恶性肿瘤和心血管疾病的重要手段。血管新生包括出芽新生和内向新生2种基本方式。出芽新生以血管内皮细胞出芽的形式长出新生血管，主要由血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)通过Delta-Notch信号转导通路所介导［5］。内向新生也称为分裂新生，是间质组织侵入已存在的血管中，将原有血管分隔成2段。血管的内向新生比出芽新生更加快速，主要在胚胎发育过程中发挥作用。内向新生的发生机制尚未完全明了，研究发现，内向新生可由包括VEGF-A在内的多种生长因子和信号转导通路所介导［6］。此外，高灌流区血管壁的机械张力也可刺激内向新生的发生［7］。

内皮祖细胞在新生血管形成过程中也发挥重要作用。在大血管中，内皮祖细胞存在于血管内膜和外膜的表面。骨髓中也存在内皮祖细胞，并且在应激情况下会释放进入血液中。在机体缺血损伤区域，内皮祖细胞能够在损伤部位形成新生血管，促进血流恢复和创伤修复。将内皮祖细胞移植进入心肌梗死模型鼠体内，48 h内在梗死部位即发现移植细胞浸润，而在非梗死区则没有发现。移植2周后，梗死部位开始出现新生血管，且新功能得到显著改善［8］。

3 激肽释放酶-激肽系统在心肌梗死中的作用

激肽及其受体在心肌梗死后的作用及其与RAAS系统的相互作用是研究的热点之一。动物实验证实，心肌梗死后激肽受体表达上调，并一直持续到心梗后3 周［9］。Koch 等［10］发现，心肌梗死后激肽释放酶基因的表达上调可以减轻心肌损伤和重塑。将血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利用于激肽原缺乏的心肌梗死大鼠后，其抑制心室重构的有益作用明显减弱，提示血管紧张素转换酶抑制剂的抑制心室重构作用是通过激肽发挥的［11］。Kakoki等进一步研究指出，血管紧张素转换酶抑制剂或激肽酶Ⅱ抑制剂可以减少BK的降解，进一步激活B2受体，增加NO的产生。多数研究均证实，B2受体在心肌梗死后发挥着重要的保护作用，如减少心室扩张、抗心肌凋亡和重塑［12-13］。此外，B1受体在心肌缺血中的作用也引起了研究者的关注。Xu等［14］研究发现，B1受体敲除小鼠的心肌梗死模型与野生型小鼠相比无明显变化。然而，研究证实，B1受体可促进心肌梗死后血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂对RAAS系统作用。多种血管紧张素转化酶受体抑制剂可与B1受体直接结合，增加NO的生成，发挥保护性作用［15］。Duka等［16］研究发现，B1与B2受体共同促进血管紧张素转化酶抑制剂在心肌梗死后发挥保护性作用。B2受体敲除鼠心肌梗死后接受血管紧张素转化酶抑制剂治疗，其心功能无显著改善，提示B1受体可能发挥更加复杂的作用，并在心肌梗死的不同时期发挥不同的作用。在早期的炎症反应中，与RAAS系统抑制剂相互作用，发挥效应。此外，大量研究表明，KKS系统在炎症中发挥作用以及B1受体和B2受体在免疫细胞表面有表达。心肌梗死后早期单核细胞和中性粒细胞会浸润到梗死心肌中，清除凋亡的细胞，在非炎症环境中表达B2受体;而在诸如缺血性损伤等炎症环境中B1受体的表达会上调［17］。Dabek等［18］在急性冠脉综合征的患者中观察到了循环单核细胞B1受体表达上调。Santos等［19］发现，B1受体通过CXCL5介导中性粒细胞等白细胞的募集和迁移;并与B2受体共同作用通过调控CCL2募集单核细胞。心肌梗死早期这一免疫反应的增强作用以及是否会诱导氧化应激反应仍需要进一步确定。此外，B1受体和B2受体究竟是单独发挥作用还是联合发挥作用仍待证实［20］。

4 激肽释放酶-激肽系统在血管新生中的作用

4.1 缓激肽促进血管新生

高分子量激肽原和低分子量激肽原通过激肽释放酶产生的缓激肽可促进血管再生。研究表明，BK可以通过与B1受体结合使bFGF表达上调，或与B2受体结合使VEGF表达上调，从而促进血管新生［21-22］;或通过调控血管通透性［23］，通过与B2受体结合促进细胞增殖［24］，进而促进血管再生。BK可以激活VEGF的受体KDR/Flk-1，导致内皮细胞eNOS的激活，进而促进血管新生。在B2受体敲除鼠模型体内，进一步证实了ACEI类药物的促血管新生的作用系B2受体所介导［25］。大量的研究已经证实了激肽可通过与B1和B2受体结合诱导Akt磷酸化，进而激活eNOS和 FGF［21，26-27］。Stone 等［28］发现，激肽可促进 B2 受体依赖的内皮细胞增殖，并增强周细胞和血管平滑肌细胞的迁移能力。此外，激肽释放酶基因沉默后会抑制循环血液中具有促血管新生能力细胞的修复功能和迁移能力，激肽释放酶基因敲除鼠模型中内皮祖细胞功能也受到了抑制。接受激肽释放酶基因转染后，循环血液中具有促血管新生能力细胞的功能恢复，B2受体依赖的一氧化氮合酶和MMPs合成恢复正常［29］。同时，KLK1表达水平与左室功能呈现出相关性，其表达水平的增高能显著改善左室舒缩功能。此外，激肽还可通过不依赖B2受体的途径，刺激血管新生过程中的关键酶基质金属蛋白酶(MMPs)的生成。

4.2 B2受体通路对内皮祖细胞的作用

激肽释放酶-激肽系统的激活还可以募集循环中的内皮祖细胞(EPCs)。骨髓中的单核细胞和EPCs在心肌梗死等缺血性疾病中具有重要作用。EPCs是体内的循环干细胞，可以修复损伤的内皮细胞，在新生血管形成中发挥作用。前文已述及心肌梗死后激肽释放酶-激肽系统可通过B1和B2受体激活单核细胞。Spillmann等［30］发现，激肽释放酶-激肽系统激活后可刺激心脏祖细胞的归巢，抑制凋亡，促进新生血管的形成。Krankel等［31］研究发现，B2受体信号通路可使EPCs大量募集到下肢缺血部位，并发挥促血管新生的作用。正常情况下，CD133+和CD34+EPCs表面表达B2受体，不表达B1受体。缓激肽通过与B2受体结合，激活 PI3K/eNOS信号传导通路，使 CD133+和CD34+EPCs大量募集到缺血损伤部位，并使其表现出对缓激肽的高趋化性。将B2受体阻断后，骨髓单核细胞的归巢和血管再生过程均受到抑制。可见B2受体在血管新生和循环EPCs募集过程中具有不可替代的作用。

4.3 激肽释放酶-缓激肽系统促进缺血下肢血管新生过程

激肽释放酶-激肽系统在肢体缺血性损伤中同样发挥重要的作用。研究已证实，激肽释放酶可促进缺血下肢的新生血管形成。将人组织激肽释放酶基因移植入1型糖尿病模型鼠，结果其微血管损伤减轻，肢体缺血症状显著改善。给予股动脉结扎模型鼠注射激肽释放酶、缓激肽或B1受体阻滞剂，3周后接受激肽释放酶和缓激肽注射的模型鼠缺血肢体的血液灌注显著恢复，血管密度增加。这些结果说明激肽能够通过促进新生血管形成，从而有效地治疗下肢缺血［32］。

4.4 HKa抑制血管新生

血管新生的过程受到一系列蛋白的正性和负性调控，如bFGF和VEGF。血浆激肽释放酶-激肽系统在血管新生的过程中发挥重要的作用。血浆激肽释放酶-激肽系统包括因子Ⅻ、前激肽释放酶和高分子量激肽原。因子Ⅻ转变为Ⅻa，后者使血浆中的前激肽释放酶转换为激肽释放酶，激肽释放酶又反馈调节因子Ⅻ转变为Ⅻa。血浆中的激肽释放酶和因子Ⅻ将高分子量激肽原水解为缓激肽和Hka。Colman等［33］最早报道Hka是血管新生的抑制剂，可以抑制内皮细胞增殖和迁移，阻止bFGF诱导的新生血管形成。体内实验进一步证实了上述观点［20］。Guo等［34］发现，Hka抑制 bFGF 介导的增殖期细胞DNA的从头合成，使G1/S期重要的调节蛋白-细胞周期蛋白D1的表达降低。Hka同样会抑制由VEGF、HGF和PDGF介导的内皮细胞增殖，诱导增殖期细胞发生凋亡［35］，造成 Cdc2激酶表达增高［36］。Cdc2激酶是细胞周期依赖的蛋白激酶，在G2/M期发挥作用。由Hka导致的Cdc2表达水平的增高与凋亡密切相关，是细胞周期重要的调节因子。可见Hka可以抑制内皮细胞的增殖，从而抑制血管新生的作用。

内皮细胞能否有效地黏附在细胞外基质上是血管新生的一个关键环节。研究［37］发现，若内皮细胞无法黏附在细胞外基质上就会迅速凋亡。Hka同样能够通过阻止内皮细胞黏附细胞外基质而发挥抑制血管新生的作用。Hka还可以诱导生长在玻连蛋白上的内皮细胞发生凋亡［38］，而玻连蛋白在血管重塑和损伤修复中发挥重要作用。Guo等［39］指出，Hka通过抑制黏着斑激酶和桩蛋白的磷酸化发挥抗黏附和诱导凋亡的作用。

4.5 Hka的受体uPAR介导Hka诱导凋亡的作用

研究发现，Hka通过uPAR与内皮细胞结合，而这一作用可被抗uPAR抗体所阻断。uPAR与整联蛋白αVβ3的相互作用是血管新生过程中的重要环节。在没有Hka参与的情况下，玻连蛋白可以分别与αVβ3和 uPAR结合，而 αVβ3和 uPAR也可互相结合。uPAR募集小窝蛋白，后者为yes的激活提供微环境。yes使黏着斑激酶发生磷酸化，从而进一步使桩蛋白发生磷酸化。这一系列的磷酸化信号促进内皮细胞的黏附、迁移和增殖。Hka可以和玻连蛋白竞争结合uPAR，此外，Hka还能与玻连蛋白形成复合物，阻止玻连蛋白与 αVβ3 结合［40］。

目前，关于激肽释放酶-激肽系统在心脏和其他组织缺血性疾病的血管新生过程中的作用正在进一步的研究中，有很多问题尚未弄清。阐明该系统在血管新生过程中的作用可帮助研究者进一步了解缺血性疾病的病理过程。有效地发挥激肽释放酶-激肽系统在新生血管形成中的有益作用，将为临床上治疗心肌梗死等缺血性疾病提供新的治疗靶点。

［1］KRAUT H，FREY E K，WERLE E.Der Nachweis eines Kreislaufhormon in de pankreasdruse［J］.Hoppe Seyler Z Physiol Chem，1930，189(1):97-106.

［2］JULIE C，SHEN B，GAO L，et al.Tissue kallikrein in cardiovascular，cerebrovascular and renal diseases and skin wound healing［J］.Biol Chem，2010，391(4):345-355.

［3］LEEB L，MARCEAU L M，MULLER E W，et al.Classification of the kinin receptor family:from molecular mechanisms to pathophysiological consequences［J］.Pharmacol Rev，2005，57(1):27-77.

［4］CAYLA C，TODIRAS M，ILIESCU R，et al.Mice deficient for both kinin receptors are normotensive and protected from endotoxin-induced hypotension［J］.FASEB J，2007，21(8):1689-1698.

［5］CARMELIET P，de SMET F，LOGES S，et al.Branching morphogenesis and antiangiogenesis candidates:Tip cells lead the way［J］.Nat Rev Clin Oncol，2009，6(6):315-326.

［6］BURRI P H，HLUSHCHUK R，DJONOV V.Intussusceptive angiogenesis:Its emergence，its characteristics，and its significance［J］.Dev Dyn，2004，231(3):474-488.

［7］KURZ H，BURRI P H，DJONOV V G.Angiogenesis and vascular remodeling by intussusception:From form to function［J］.News Physiol Sci，2003，18:65-70.

［8］JOHN P K，XU Q B.Endothelial precursors in vascular repair［J］.Microvasc Res，2010，79(3):193-199.

［9］TSCHOPE C，HERINGER W S，WALTHER T.Regulation of the kinin receptors after induction of myocardial infarction:a mini-review［J］.Braz J Med Biol Res，2000，33(6):701-708.

［10］KOCH M，SPILLMANN F，DENDORFER A，et al.Cardiac function and remodeling is attenuated in transgenic rats expressing the human kallikrein-1 gene after myocardial infarction［J］.Eur J Pharmacol，2006，550(1-3):143-148.

［11］KOCH M，BONAVENTURA K，Spillmann F，et al.Attenuation of left ventricular dysfunction by an ACE inhibitor after myocardial infarction in a kininogen-deficient rat model［J］.Biol Chem，2008，389(6):719-723.

［12］MICHAEL R W，JESSIE L，DUNCAN J S."B2 or not B2?":Kinin Receptors and Endothelial Progenitor Cell Dysfunction［J］.Circ Res，2008，103(11):1202-1203.

［13］CHAO J，YIN H，GAO L，et al.Tissue kallikrein elicits cardio protection by direct kinin b2 receptor activation independent of kinin formation［J］.Hypertension，2008，52(4):715-720.

［14］XU J，CARRETERO O A，SHESELY E G，et al.The kinin B1 receptor contributes to the cardioprotective effect of angiotensinconverting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers in mice［J］.Exp Physiol，2009，94(3):322-329.

［15］ IGNJATOVIC T，TAN F，BROVKOVYCH V，et al.Novel mode of action of angiotensin I converting enzyme inhibitors:direct activation of bradykinin B1 receptor［J］.J Biol Chem，2002，277(19):16847-16852.

［16］DUKA A，KINTSURASHVILI E，DUKA I，et al.Angiotensinconverting enzyme inhibition after experimental myocardial infarct:role of the kinin B1 and B2 receptors［J］.Hypertension，2008，51(5):1352-1357.

［17］SCHULZE T U，PRAT A，BADER M，et al.Roles of the kallikrein/kinin system in the adaptive immune system［J］.Int Immunopharmacol，2008，8(2):155-160.

［18］ DABEK J，KULACH A，SMOLKA G，et al.Expression of genes encoding kinin receptors in peripheral blood mononuclear cells from patients with acute coronary syndromes［J］.Intern Med J，2008，38(12):892-896.

［19］DOS S，ROFFE E，ARANTES R M，et al.Kinin B2 receptor regulates chemokines CCL2 and CCL5 expression and modulates leukocyte recruitment and pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)in mice［J］.J Neuroinflammation，2008，5(5):49.

［20］KONSTANTINOS S，DIRK W，HEINZ P S，et al.Kinins in cardiac inflammation and regeneration:Insights from ischemic and diabetic cardiomyopathy［J］.Neuropeptides，2010，44(2):119-125.

［21］PARENTI A，MORBIDELLI L，LEDDA F，et al.The bradykinin/B1 receptor promotes angiogenesis by up-regulation of endogenous FGF-2 in endothelium via the nitric oxide synthase pathway［J］.FASEB J，2001，15(8):1487-1489.

［22］KNOX A J，CORBETT L，STOCKS J，et al.Human airway smooth muscle cells secrete vascular endothelial growth factor:up-regulation by bradykinin via a protein kinase C and prostanoid-dependent mechanism［J］.FASEB J，2001，15(13):2480-2488.

［23］MAEDA H，FANG J，INUTSUKA T，et al.Vascular permeability enhancement in solid tumor:various factors，mechanisms involved and its implications［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(3):319-328.

［24］SEEGERS H C，AVERY P S，McWILLIAMS D F，et al.Combined effect of bradykinin B2 and neurokinin-1 receptor activation on endothelial cell proliferation in acute synovitis［J］.FASEB J，2004，18(6):762-764.

［25］SILVESTRE J S，BERGAYA S，TAMARAT R，et al.Proangiogenic effect of angiotensin-converting enzyme inhibition is mediated by the bradykinin B(2)receptor pathway［J］.Circ Res，2001，89(8):678-683.

［26］EMANUELI C，MINASI A，ZACHEO A，et al.Local delivery of human tissue kallikrein gene accelerates spontaneous angiogenesis in mouse model of hindlimb ischemia［J］.Circulation，2001，103(1):125-132.

［27］EMANUELI C，SALIS M B，VAN L S，et al.Akt/protein kinase B and endothelial nitric oxide synthase mediate muscular neovascularization induced by tissue kallikrein gene transfer［J］.Circulation，2004，110(12):1638-1644.

［28］STONE O A，RICHER C，Emanueli C，et al.Critical role of tissue kallikrein in vessel formation and maturation:implications for therapeutic revascularization［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(5):657-664.

［29］GAIA S，ORAZIO F，DANIELA C，et al.Tissue Kallikrein Is Essential for Invasive Capacity of Circulating Proangiogenic Cells［J］.Circ Res，2011，108(3):284-293.

［30］SPILLMANN F，GRAIANI G，VAN L S，et al.Regional and global protective effects of tissue kallikrein gene delivery to the peri-infarct myocardium［J］.Regen Med，2006，1(2):235-254.

［31］KRANKEL N，KATARE R G，SIRAGUSA M，et al.Role of kinin B2 receptor signaling in the recruitment of circulating progenitor cells with neovascularization potential［J］.Circ Res，2008，103(11):1335-1343.

［32］SMITH R S，GAO L，CHAO L，et al.Tissue kallikrein and kinin infusion promotes neovascularization in limb ischemia［J］.Biol Chem，2008，389(6):725-730.

［33］COLMAN R W，JAMESON B A，LIN Y，et al.Domain 5 of high molecular weight kininogen(kininostatin)down-regulates endothelial cell proliferation and migration and inhibits angiogenesis［J］.Blood，2000，95(2):543-550.

［34］GUO Y L，WANG S，COLMAN R W.et al.An angiogenic inhibitor，inhibits proliferation and induces apoptosis of human endothelial cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21(9):1427-1433.

［35］ZHANG J C，CLAFFEY K，SAKTHIVEL R，et al.Two-chain high molecular weight kininogen induces endothelial cell apoptosis and inhibits angiogenesis:partial activity within domain 5［J］.FASEB J，2000，14(15):2589-2600.

［36］WANG S，HASHAM M G，ISORDIA S I，et al.Upregulation of Cdc2 and cyclin A during apoptosis of endothelial cells induced by cleaved high-molecular-weight Kininogen［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284(6):H1917-23.

［37］RE F，ZANETTI A，SIRONI M，et al.Inhibition of anchoragedependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells［J］.J Cell Biol，1994，127(2):537-46.

［38］Al-FAKHRI N，CHAVAKIS T，SCHMIDT W T，et al.Induction of apoptosis in vascular cells by plasminogen activator inhibitor-1 and high molecular weight kininogen correlates with their anti-adhesive properties［J］.Biol Chem，2003，384(3):423-35.

［39］ GUO Y L，WANG S，CAO D J，et al.Apoptotic effect of cleaved high molecular weight kininogen is regulated by extracellular matrix proteins［J］.J Cell Biochem，2003，89(3):622-32.

［40］ GUO Y L，COLMAN R W.Two faces of high molecular weight kininogen(HK)in angiogenesis:Bradykinin turns it on and cleaved HK(HKa)turns it off［J］.J Thromb Haemost，2005，3(4):670-676.