桔梗根的水提取物对肿瘤侵润和转移的抑制作用

毕承华

桔梗是中国传统的草药，它的免疫刺激效果和抗肿瘤效果是众人皆知的。Lee用体外和体内肿瘤转移实验检验了桔梗根水提取物的抗肿瘤转移活性［1］。CK通过一个再生的基底细胞膜抑制了B16-F10黑色素瘤细胞，并强烈抑制B16-F10黑色素瘤细胞黏附到细胞外基质，例如基质胶，纤维结合蛋白和层粘连蛋白底物。CK也抑制了实验性肺癌并延长了体内幸存时间。除此之外，CK扩大了NK细胞活性。这些结果表明了CK可能通过抑制肿瘤细胞黏附到基底细胞膜和激活NK细胞而减少B16-F10黑色素瘤细胞肺转移的程度。

桔梗的根既可食用又可作为传统的药物治疗成年疾病，例如支气管炎、哮喘、肺结核、高脂血症和炎性疾病，也作为镇静剂使用。近来，有人工栽培20年的桔梗中提取的成分changkil(CK)在大鼠身上具有抗氧化、保肝和阻止肝纤维化作用的报道。除此之外，通过Toll-like4受体样作用它也可以激活巨噬细胞。虽然CK通过调控巨噬细胞功能具有扩大免疫反应的作用，但是细胞介导的精确免疫扩增机制却是不清楚的。此外，CK其他的生物学特性，例如对于肿瘤入侵和转移的影响尚不清楚。经过以下研究，除调查CK的抗肿瘤活性，关于瘤转移的治疗抑制作用之外，还分析了CK抗瘤转移效应的机制，探讨CK是否通过激活自然杀伤细胞而增强了宿主防御系统抑制肿瘤。这项结果在于证明其在小鼠实验中有重要的抗转移活性［2］。

1 实验研究

采用每分转数为1640的介质培养基和购置的胎牛血清、从分子探针技术中得到的钙黄绿素-AM，制备了22年生桔梗根的水提取物进行了实验研究。方法是，向蒸馏水中加入粉末状根(5 ml/g)，该混合物在90℃保持10 h，冷却至室温，然后滤过和低压冻干，吸收率约是33.5%(每100 g原干燥根中含有33.5 g剩余残渣)，将得到的浅黄色水提取物(CK)直接溶解在灭菌生理盐水中。

采用的动物为Dao Han动物研究公司提供的5～6周大成年雄性小鼠，用啮齿类动物专用饲料饲养，饮水量不限，饲养环境为(21±2)℃，(50±5)%相对湿度，有12 h昼夜交替的条件。

所采用的细胞株为具有高度侵害和转移能力的鼠类黑色素瘤B16-F10，和鼠类淋巴瘤YAC-1(自然杀伤敏感靶细胞)，被保存在含 10%FBS，100 μnits/ml青霉素和 100 μg/ml链霉素，RPMI1640培养液中，以37℃，含经湿化的5%CO2的环境保存。

应用经改良的在Transwell细胞培养真空箱中进行的肿瘤细胞体外侵润分析法检测活性。方法为:将8.0 μm孔径的聚乙烯吡咯烷酮-游离聚碳酸酯过滤器用500 μg/ml的基质胶包埋后置Transweil真空室内。过滤膜在磷酸盐缓冲液(pbs)中冲洗后立即干燥。10%FBS-RPMI1640培养液放在室中低位，B16-F10细胞被放在室中高位。将CK溶液加到高位，在37℃含有5%CO2环境中培养4 h。通过0.2%结晶紫染色计数法测量穿过PVPF过滤膜基质胶包埋侵润的细胞数量。

通过96孔板，使用以往方法的改良法进行细胞黏附测定。小孔预先在室温下用 50 μl，15 μg/ml纤维结合素，10 μg/ml基质胶，或 50 μl，40 μg/ml层黏连蛋白包埋，然后用0.2 mlRPMI1640/well(包含3%BSA)，培养液在37℃密封1 h。把细胞放在RPMI1640(包含0.1%BAS)培养液中重新悬浮，加入每个孔池中(5×105/ml)，然后加入CK，充分反应。将该混悬液在37℃下培养1 h。小孔池用加热的磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗两次以除去未反应的细胞，已反应的细胞在20%甲醇中用0.2%龙胆紫水溶液染色10 min。细胞染色后，立即在200 μl1%十二烷基磺酸钠中溶解，光密度在560 nm用(microplate reader)全自动定量绘图酶标仪可以测量。

进行了细胞毒性实验，用WST-1细胞计数器测定细胞生长的水平。简言之，把10%FBS-RPMI1640培养液中的B16-F10细胞分放在有96个小孔池中，培养24 h后，把各种不同浓度的CK加到池中，37℃下再培养24 h。盐酸阿霉素用于抑制对照。把10 μl WST-1溶液加入到每个孔池中，在37℃下培养4 h，然后结束实验。450 nm处的吸光度可以用(microplate reader)全自动定量绘图酶标仪测定。

1.1 实验性肺转移体内测定 采集B16-F10对数生长细胞，用无血清RPMI1640培养液清洗，混悬，使其在磷酸盐缓冲液中具有适宜的浓度。将C57BL/6小鼠随机分成3组，每组有12只，3个组均尾静脉注射B16-F10细胞混悬液，每次0.2 ml(5×105)。将CK混悬于灭菌生理盐水中，然后用这种转移诱导作用以口服方式持续不断地喂给小鼠。这种治疗持续7 d。1组仅被注射B16-F10细胞混悬液所采用的赋形剂，2组与3组分别以20 mg/kg和100 mg/kg剂量注射CK，每天监测动物体重，将每组中的6只小鼠注射肿瘤细胞14 d后处死，将肺脏保存于Bouin's溶液(苦味酸∶20%福尔马林中性缓冲液∶乙酸=15∶5∶1)中。用立体解剖显微镜观察每组小鼠肺表面的B16-F10菌群数量，测定它们的存活率。需监测存活率两个月以上。

1.2 脾淋巴细胞的分离 将CK放在灭菌生理盐水中混悬并以口服方式喂小鼠3 d。该分离方法为以往常用的方法。细胞的成活率总是大于90%。

1.3 自然杀伤细胞活性实验 NK细胞活性可以通过形成钙黄绿素-Am释放分析来测定，这种方法是对曾报道过方法的改良。用10 μg/ml的钙黄绿素在游离血清-培养液中对YAC-1细胞标记30 min，用纯RPMI1640培养液清洗三次后，把0.1 ml标记YAC-1细胞加到96孔板中。将效应器细胞，脾淋巴细胞(0.1 ml)加到每个小孔池中来产生各种效应因子/靶因子比例，小孔板在37℃下培养4个 h，离心后，移除0.1 ml游离细胞上清液，用荧光光度计测量上清液的荧光强度，其在500nm有最大吸光强度，540 nm有最大发光强度。特有的细胞溶解活性按照如下方法计算:百分细胞溶解活性=(E-S)(T-S)×100(E是靶细胞和效应细胞的荧光吸收强度，S仅是靶细胞的荧光发射强度，T是总的荧光强度)。

1.4 统计学分析 结果以均值±标准差表示，组间差异用方差分析表，检验是否两组间存在较大的偏差，Dunnet检验用于比较两组之间的平均值。余下数据用Fisher精密度检验和卡普兰-迈耶生存曲线进行分析。若P＜0.01则在差异上有统计学意义。

1.5 实验结果如下 CK在肿瘤细胞侵润方面的作用具有高侵润和转移能力的鼠类黑色素瘤细胞群(B16-F10)进行体外侵润实验的结果表明，在Transwell细胞培养室中CK对侵润重建基底膜(基质胶)的B16-F10细胞有抑制作用。CK抑制B16-F10细胞侵润基质胶/纤维结合蛋白-包埋过滤膜的作用呈现浓度依赖方式，浓度约为20 μg/ml的CK浓度可以抑制50%细胞。

CK在肿瘤细胞与ECM黏附方面的作用可以测定出CK对B16-F10细胞黏附ECM组分的作用，因为肿瘤细胞与ECM的黏附作用是肿瘤侵润作用中最基本的一步。将B16-F10细胞用浓度1～100 μg/mlCK进行处理，CK可以抑制B16-F10黑色素瘤细胞与基质胶(IC50=43 μg/ml)和纤维结合蛋白(IC50=62 μg/ml)黏附，该作用是呈现浓度依赖方式。CK强烈地抑制B16-F10细胞与层黏连蛋白结合，浓度是31 μg/ml的CK呈现最大抑制细胞黏附作用。在下面一系列的实验中进一步测定了CK抑制B16-F10细胞与层黏连蛋白底物结合的机制。用浓度为1-100 μg/mlCK在冰上培养B16-F10细胞1 h，然后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)培养。在另外的实验中，包埋的层黏连蛋白底物在37℃下培养3 h，用PBS液清洗。表明CK阻碍B16-F10细胞与层黏连蛋白黏附呈现浓度依赖的方式。然而，用CK对底物没有这样的抑制作用。

CK对B16-F10黑色素瘤细胞的细胞毒性效应WST分析以检测CK的抗黏附作用是否由基于细胞毒性的假阳性作用引起。CK在1-100 μg/ml范围内无影响对B16-F10细胞24 h培养中的生长。另一方面，盐酸阿霉素作为阳性对照，对体外细胞生长有潜在的抑制作用。CK浓度超过800 μg/ml显示有轻细胞毒性作用(数据没有表明)。这些结果说明CK对肿瘤细胞黏附和侵润作用不是由于CK的细胞毒性作用。

2 CK对肺转移和存活率的影响

因为上面的结果阐释CK在体外实验中对肿瘤侵润有显著的抑制作用，这项研究检测CK在体内实验对肺转移的影响，通过给C57BL/6小鼠静脉注射B16-F10黑色素瘤细胞产生肺转移酶，结果显示用CK处理过的小鼠肺转移酶数量与未处理的比较呈现CK浓度依赖型减少。尤其，用100 mg/kg浓度CK处理小鼠可以抑制65%的肺转移数量。在这个剂量下，不但对小鼠体重没有影响，也没有任何其他毒性临床症状。这些结果阐释了CK口服有剂量依赖型抗转移活性。100 mg/kg剂量处理小鼠后存活期高于对照组二倍多。

2.1 CK对体内NK细胞活性的影响 CK对先天宿主反应的作用机制可被检测，尤其是NK细胞扩增，因为同时给与CK在阻止肿瘤转移是有效的。NK细胞的扩增表明具有抑制瘤转移的作用。在此项研究中，CK连续3 d给药后，用脾淋巴细胞作效应细胞，YAC-1细胞做靶细胞检测一天NK细胞的活性。结果表示CK以剂量依赖的方式显著的提高脾NK细胞活性。脾淋巴细胞活性被增加的同时，注射CK 3 d后NK细胞活性达到最高。因此，CK可以激活体内NK细胞的活性。该研究表明CK以剂量依赖的方式较强地抑制肺转移，肺转移由注射B16-F10黑色素瘤细胞产生。

3 结论

肿瘤细胞侵润细胞外基质是瘤转移过程中重要的一步。细胞外基质蛋白质通过与细胞表面受体结合促进细胞黏附。这个研究表明使用重建基底膜(体外基质胶)，CK可以抑制B16-F10细胞侵润。一项体外黏附实验说明CK成功地阻碍了B16-F10黑色素瘤细胞黏附于细胞外基质蛋白质，例如基质胶，纤维结合蛋白和层黏连蛋白，该一致作用呈现浓度依赖的方式。用CK短期预处理B16-F10细胞可阻碍细胞黏附于层黏连蛋白，该事实说明抑制细胞黏附于层黏连蛋白底物与CK和肿瘤细胞表面结合有关而并非与层黏连蛋白底物有关。然而，详细的机制仍不清楚。一个可能的解释是CK与层黏连蛋白的受体(例如在肿瘤细胞表面的一种抗抑郁药)结合，这种结合使CK抑制了肿瘤细胞的黏附与侵润。24 h的培养过程中，CK在研究所使用的浓度下未显示任何的细胞毒性反应。这表明CK的抗黏附和抗侵润作用不是由于细胞毒性产生的。许多报道说明生物活性化合物的抗肿瘤活性通过刺激免疫系统与不同的源物质分离开来。从当归属中分离出来的当归和青牛胆属考狄叶素增强了B16-F10黑色素瘤细胞植入小鼠的免疫功能，并增加了这些鼠的生存率，同时也抑制了细胞瘤转移。Song报道了人参的免疫刺激和抗肿瘤作用［3］。这些报道表明来自天然资源的免疫刺激活性物质是研发抗肿瘤药物很好的候选物质。许多实验和临床研究表明先天免疫性在免疫监视和阻断原发肿瘤转移中起着重要的作用。体外长期和短期实验都表明CK既不会对肿瘤细胞产生毒性也不会抑制细胞增殖。这些结果也暗示在减少CK处理过动物瘤转移过程中，也涉及到了免疫系统。进一步讲，肿瘤减少也可能是通过β-细胞或非特异性免疫细胞(例如NK细胞)介导的，因为CK选择性的激活B细胞和巨噬细胞，但不能激活T细胞。这些结果说明，CK可能调节了先天宿主防御系统机制。除此之外，对抗肿瘤自然免疫系统相关的效应器也被确认为是NK细胞。实际上，许多研究者已经报道了免疫兴奋剂激活NK细胞导致肿瘤转移减少。事实上，肿瘤发病率和转移在小鼠身上是高发的。除此之外，据报道邻-半乳糖酰基鞘氨醇可以增加体内NK细胞的数量，也可以抑制肿瘤转移酶。因此，更有效力的NK扩增剂具有潜在的抗肿瘤活性，但是目前适合的分子靶点还没有确定。因此，这项研究依据NK细胞的激活作用分析了CK抑制瘤转移的机制。CK显著地增强了体内NK的活性。

总之，Lee的实验证明了CK在体外和体内均显示出了抗瘤转移效应［3］。这些结果表明CK的抗转移活性可能是由于阻断了NK细胞抗癌时的黏附和扩增。但是CK抗肿瘤活性是否是由于在体内阻断了一种抗抑郁药integrin介导的黏着作用需要更进一步的研究。CK对于改善肿瘤侵润和寻找转移治疗方法可能会提供一个潜在的平台，它尤其适合于手术后肿块的清除和癌症的复发治疗。

［1］Lee，E.B.，1973.Phanmacological studies on Platycodon grandiforum A.DC.IV.A comparison of experimental pharmacological efxcts of crude platycodin with clinical indications of piatycodi radix.Yak-ugaku Zasshi93，1188-1194.

［2］Lee，K.，J.，Jeong，H.G.，2002Protective efoct of platycodi radix on carbontetrachloridc-induced hepatotoxicity.Chem Toxicol.40:517-525.

［3］SongJ.Y.，Han，S.K.，Son，E ＞ H.，Pyo，S.N.，Yun，Y.S.，Yi，S.Y.，2002，Induction of sceretory and tumorieidal aetivities in peritoncal macro-phages by ginsan. Int. Immunopharmaeol.2:857-865.