犬瘟热诊断技术

犬瘟热诊断技术

一、范围

本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的操作方法。

二、试剂和材料

2.1 改良最低要素营养液（DMEM）培养基

2.2 非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）

2.3 磷酸盐缓冲液（PBS）

2.4 青霉素、链霉素

2.5 CDV阳性血清：中和抗体效价1·1024。

2.6 CDV阴性血清：无CDV感染的犬血清。

2.7 本科结合物：HRP标记的葡萄球菌A蛋白（SPA）。

2.8 底物溶液

2.9 过氧化氢甲醇溶液

2.10 盐酸酒精溶液

2.11 胰蛋白酶溶液

2.12 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，-20℃保存。

2.13 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为5U/μL，-20℃保存。

2.14 RNA酶抑制剂（40U/ μL）：-20℃保存。

2.15 dNTP：含dATP、dGTP、dTTP各10mmol/L, -20℃保存。

2.16 引物：浓度为20μmol/L,其序列如下：

上游引物（CDVR）：5'CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT3'

下游引物（CDVR）：5'CCT CCA AAG GGT TCC CAT GA3'

随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为5U/μL，-20℃保存。

DEPC水：自配或购买商品化DEPC水。

Trizol试剂：4℃保存。

异丙醇：使用前预冷至-20℃。

75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至于20℃。

1.5mL无RNA酶的Eppendorf管。

0.2mL无RNA酶的PCR薄壁管。

三、器材和设备

3.1 细胞培养瓶（中号瓶）

3.2 二氧化碳培养箱

3.3 恒温水浴箱（5℃～100℃）

3.4 普通光学显微镜

3.5 0.45μm微孔滤膜

3.6 离心机

3.7 PCR扩增仪

3.8 水平电泳仪

3.9 40个小孔的室玻片

3.10 冷冻切片机

3.11 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000g以上

3.12 凝胶成像系统

四、临床检查

4.1 临床症状

4.1.1 病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。

4.1.2 腹下可见米粒大丘疹。

4.1.3 病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。

4.2 病理变化

4.2.1 新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩；成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。

4.2.2 表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。

4.2.3 中枢神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。

4.2.4 犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1μm～5μm，可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现，核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。

4.3 判定

若临床症状符合4.1.1或4.1.3且出现4.2.4的病理变化，则可判定疑似犬瘟热，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR检测等方法确诊。

五、 病毒分离

5.1 样品采集和处理

5.1.1 活犬可采集泪液、鼻液、粪便，病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。

5.1.2 上述样品用无血清DMEM制成20%组织悬液，10000r/ min离心20min，取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液用于CDV分离。

5.2 操作方法

5.2.1 细胞培养

用含8%新生牛血清的DMEM培养基在细胞培养瓶（中号瓶）培养Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱，单层细胞长至80%～90%时，接种样品上清。

5.2.2 病料接种

用0.1mL处理好的样品上清接种Vero细胞，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h，加入无血清DMEM继续培养5d～7d，观察结果。

5.3结果判定

若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分离阴性。若Vero细胞培养4d～5d出现细胞病变（如细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成合胞体，并在胞浆中出现包涵体），可用免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进行确诊。

六、免疫酶检测

6.1操作方法

6.1.1 将CDV标准株和待鉴定的样品分别接种Vero细胞，接种后5d～7d，病变达50%～75%时，用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1X106个/ mL细胞。取有40个小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包装，置-20℃备用。

6.1.2 取出室玻片，室温干燥后，每份10倍稀释的CDV阳性血清和阴性血清，每份血清滴加到两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，置恒温水浴箱37℃孵育30min。

6.1.3 PBS漂 洗3次，每次5min，室温干燥。

6.1.4 滴加1∶100稀释的酶结合物，置湿盒内，用恒温水浴箱37℃孵育30min。

6.1.5 PBS漂 洗3次，每次5min。

6.1.6 将室玻片放入底物溶液中，室温下显色5min～10min。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。

6.1.7 吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。

6.2 结果判定

6.2.1 若CDV阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色，且CDV阳性血清与正常细胞反应无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。

6.2.2 在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈无色，判为CDV阴性，相应动物犬瘟热感染阴性。

6.2.3 在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈无色，而与CDV阳性血清反应呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。

七、 免疫组织化学检测

7.1 样品处理

对疑似CD的病死犬或捕杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cmX1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定、保存、送检。

7.2 操作方法

7.2.1 新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风干后用丙酮固定10min～15min，新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片（切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱）。

7.2.2 去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37℃作用20min。

7.2.3 胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min，以便充分暴露抗原。

7.2.4 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.5 封闭：滴加体积分数为5%的新生牛血清或1∶10稀释的正常马血清，37℃湿盒中孵育30min。

7.2.6 加10倍稀释的CDV阳性血清或阴性血清，37℃湿盒中孵育1h或37℃湿盒中孵育30min后4℃过夜。

7.2.7 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.8 加1∶100稀释的酶结合物，37℃湿盒孵育1h。

7.2.9 漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。

7.2.10 底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min～10min后漂洗。

7.2.11 从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。

7.2.12 试验同时设阳性、阴性血清对照。

7.3 结果判定

7.3.1 被检组织与阴性血清作用后应无着染，若出现黄色或棕褐色着染，判定阴性对照不成立，应重复实验。

7.3.2 在符合7.3.1的条件下，被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰，细胞浆内呈现黄色或棕褐色着染，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。

八、 RT-PCR检测

8.1 病料的采集及处理

采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CDV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。

8.2 RNA抽提

分别取100μL待检样品、CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装入1.5mL无RNA酶的Eppendorf管，加入1mL Trizol试剂，用枪头充分吹打20次～30次；13000g离心15min；取上层水相，加500μL异丙醇，颠倒数次混匀，-20℃放置20min；13000g离心10min；加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采用市售的商品化RNA抽提试剂盒进行。

8.3 cDNA模板制备

取17 μLRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP1.5μL、随机引物2μL、RNA酶抑制剂1μL、逆转录酶1μL，室温放置10min后，置PCR仪上经42℃、60min，70℃、10min。

8.4 PCR检则

在0.2mLPCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶0.5μL、cDNA模板2μL、上游引物和下游引物（CDVF、CDVR）各0.5μL、三蒸水18.5μL，配制PCR检则体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增：首先94℃、30s，55℃、30s、72℃、40s进行35个循环；最后72℃、3min。用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板（含0.5μg/mLEB，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10μLPCR产物和2μL加样缓冲液（6X）混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。

8.5 结果判定

8.5.1 经RT-PCR检测，CDV阳性对照样品可扩增出大小为455bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，否则试验结果视为无效。

8.5.2 在符合8.5.1的条件下，若待检样品扩增出了大小为455bp的核酸片段，则初步判定犬瘟热病毒核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为455bp，则判定犬瘟热病毒核酸阴性。

8.5.3 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性≥90%，则可确诊为犬瘟热病毒核酸阳性，否则判定犬瘟热病毒核酸阴性。

8.5.4 若犬瘟热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬瘟热病毒感染阳性。