马耳他布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测

吴 杰，吴树清，李东兴，刘艳琴，张明月，海 岩

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古疾病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010018）

布鲁菌病是由布鲁菌属细菌引起的动物源性疾病，是一种人畜共患传染性疾病，该病在我国发病呈逐年上升趋势［1］。它主要引起人类波状热和慢性感染以及反刍动物流产和睾丸炎等，目前尚无根治方法。大量研究表明，布鲁菌的外膜蛋白具有很强的免疫原性［2-3］。omp25是布鲁菌ompA家族成员之一，omp25基因在布鲁菌各个种属之间有很高的保守性［4］。本试验克隆了马耳他布鲁菌omp25基因，在大肠埃希菌Rosetta中表达，用纯化的表达产物进行Western-blot分析，发现重组蛋白具有免疫原性。为检测布鲁菌病及研制布鲁菌亚单位疫苗提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 马耳他布鲁菌为内蒙古农业大学微生物实验室分离株。pET-32a、Rosetta购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试剂 T4连接酶，DNA Marker、蛋白Marker、IPTG和限制性内切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗羊IgG，购自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，浓度2OD／管，储存液浓度100μmol／L。羊种布鲁菌阳性血清和标准阴性血清由本实验室保存，其他常规试剂均为国产试剂。

1.3 目的片段的扩增 根据GenBank上发表的M16布鲁菌的omp25的基因序列设计马耳他布鲁菌上下游引物P1：5′cgcctcgagttagaacttgtagt 3′，P2：5′ccgggatccatgaaatccgtaat 3′（分别加入Eco RⅠ和Xho lⅠ酶切位点）。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性40s，55℃复性45s，72℃延伸45s；30个循环，最后72℃延伸10min。同时设去离子水对照。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。

1.4 omp25基因表达载体的构建 PCR产物经限制性内切酶Eco RⅠ、Xho lⅠ双酶切处理，1%琼脂糖凝胶电泳，回收预期的omp25基因片段与同样处理的pET-32a表达载体16℃连接过夜，转化至Rosetta中，涂LB平板（氨苄青霉素和氯霉素抗性），37℃培养过夜，挑取单克隆菌落37℃过夜摇菌，碱变性法提取质粒，进行PCR和Eco RⅠ、Xho lⅠ双酶切鉴定。挑取阳性单克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并与GenBank报道的omp25基因序列进行同源性比较。将重组质粒命名为pET-32a-omp25。

1.5 pET-32a-omp25重组蛋白的诱导表达 含重组质粒的菌液按1∶100的量接种在LB培养基中（含氨苄青霉素，氯霉素50μg／mL），37℃振荡培养至OD600值约为0.6～1.0，再加入IPTG使其终浓度达到1mmol／L。37℃继续培养，经12%分离胶检测表达情况。

1.6 表达产物的纯化和Western-blot检测 将上述的诱导表达样品以10000r／min离心收集菌体，沉淀物用原收集菌液量1／5体积的PBS悬浮，置冰浴中超声波处理10min，10000r／min（4℃）离心10 min，分别收集上清和沉淀。按照His GraviTrap和His GraviTrap Kit的说明书，对融合蛋白进行重力流纯化，对纯化产物进行SDS-PAGE分析。将纯化蛋白经SDS-PAGE后再转到NC膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，PBST缓冲液洗3次，加入布鲁菌病阳性血清（1∶100倍稀释）37℃作用2h，PBST缓冲液洗3次，再加入兔抗羊IgG辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（1∶2000倍稀释），37℃作用1h，PBST缓冲液洗3次，DAB显色液中避光显色2～10min。

2 结果

2.1 pET-32a-omp25重组质粒的鉴定 pET-32aomp25重组质粒经PCR和Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，得到了预期大小的642bp片段。测序结果表明，目的基因omp25正向插入pET-32a载体（见图1）。

图1 重组质粒pET-32a-omp25的PCR及双酶切鉴定

2.2 表达产物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析结果表明，经1mmol／L的IPTG诱导的5h基因工程菌获得表达，产生约43kDa的特异性蛋白条带（见图2）。

图2 表达产物的SDS-PAGE

2.3 表达产物的纯化及Western-blot检测结果纯化产物经SDS-PAGE电泳分析表明获得了高纯度的目的蛋白。Western-blot分析结果表明，表达的目的蛋白能与马耳他布鲁菌阳性血清发生特异性反应，43kDa处出现特异免疫反应条带（见图3）。

图3 表达产物纯化的SDS-PAGE及Western-blot分析

3 讨论

omp25是布鲁菌外膜结构蛋白［5］，是具有代表性的第3组外膜蛋白［6］。在布鲁菌各个种属之间具有高度的保守性，同源性达98%以上。布鲁菌omp25基因的缺失可引起布鲁菌的毒力减弱，并能够对宿主起到免疫保护作用［7］。Philpper从B.abortus544基因库中，以抗omp25单克隆抗体调出了omp25基因，并分析了其脱氧核糖核苷酸序列omp25基因长约917bp，在起始密码子6个碱基前有7个核苷酸序列（TAAGGAG）与大肠杆菌16sRNA序列具有同源性，估计是核糖体结合位点。布鲁菌细胞壁膜结构是大多数细菌识别宿主的独特标志物，能绑定胞外的许多基质蛋白，特别是纤维连接素和玻璃体粘连蛋白，这也是许多其他的病原微生物普遍存在的一个属性。研究证实布鲁菌表面主要的抗原成分是LPS和omps。到目前为止，己发现有7种主要omps［8］，它以共价键的形式与细胞外膜的肤聚糖（PG）层紧密结合。

本试验证实omp25蛋白表达量高，占总菌体蛋白的含量高，具有良好的免疫反应原性，具备作为免疫学活性抗原的潜力和优势，为疫苗的开发和免疫学检测方法的建立提供了候选抗原。

［1］文学忠，于瑞华，姜秋杰.布鲁氏菌病近况［J］.吉林畜牧兽医，2007，5：20-23.

［2］Bowden R A，Cloeckaert A，Zygmunt M S，et al.Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB／c mice of the 25-kDa major outer-membrane protein of Brucella melitensis（OMP25）expressed in Escherichia coli［J］.J Med Micobiol，1998，47：39-48.

［3］Brocker B J，Tabatabai L B，Mayfeld J E.Conserbation of antigenicityin a 31-kDa Brucella protein［J］.Vet Microbiol，1998，18：313-525.

［4］Matthew D，Edmonds，Cloeckaert A，et al.Brucella species lacking the major outer membrane protein Omp25are attenuated in mice and protect against Brucella ovis［J］.Vet Micobiol，2002，88：205-221.

［5］Bowden R A，Verger J M，Grayon M，et al.Rspid identification of rough Brucella isolates bu a latex coagglutination assay with the 25-lilodalton outer membrane protein and rough-lipopolysaccharide specific monoclonal antibodies［J］.Clin Diagn Lsb Innunol，1997，4（5）：611-614.

［6］Oliveira S C，Splitter G A.Immunization of mice with recombinant L7／L12ribosomal protein confers protein confers protection against Brucella abortus infection［J］.Vaccine，1996，14（10）：959-962.

［7］Edmonds M D，Cloeckaert A，Booth N J，et al.Attenuation of a Brucella abortus mutant lacking a major 25kDa outer membrane protein in cattl［J］.Ameri J Vet Res，2001，62（9）：1461-1466.

［8］Cloeckaert A，Zymunt M S，Wergifosse P，et al.Demonstration of pertidoglycan-associated Brucella outer-membrane proteins by use of monoclonal antibodies［J］.J Gen Microbiol，1992（138）：1543-1550.