益肾导痰调冲汤对多囊卵巢综合征大鼠瘦素及其受体和IGF-IR表达的影响

卢莉莉 程 泾 浙江省温州中山医院中西医结合生殖中心 温州 325014

程 蕾 黄 鹏 浙江省温州市鹿城中山医药保健研究所

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是以长期无排卵及高雄激素为特征的内分泌综合征，也是生育期妇女月经失调和无排卵不孕患者最常见的原因[1]。近年来，瘦素（Lep）、瘦素受体（OB-R）及胰岛素样生长因子I受体（IGF-IR）在PCOS发生发展中的作用已逐渐受到重视。益肾导痰调冲汤是程泾教授的经验方，本实验观察该方对多囊卵巢综合征大鼠瘦素及其受体和胰岛素样生长因子I受体（IGF-IR）表达的影响。

1 实验材料

1.1 动 物 SPF级雌性SD大鼠70只，21日龄，体质量（50±10）g，由温州医学院实验动物中心提供和饲养，许可证号：SYXK（浙）2005-0061。

1.2 药 物 丙酸睾酮注射液（规格：1 mL/25 mg，天津金耀氨基酸有限公司）；注射用绒促性素（规格：1000U/支，丽珠集团丽珠制药厂）；桂枝茯苓丸（规格：每100丸重10 g，山西华康药业股份有限公司）；达英-35（规格：每片含醋酸环丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg，拜耳医药保健有限公司广州分公司）；益肾导痰调冲汤（由仙灵脾、菟丝子、杞子、胆南星、白芥子、法半夏、石菖蒲、水蛭、海藻、山慈菇、丹参、香附、茺蔚子等组成，规格：100 mL/袋，每毫升含生药2.3 g，由温州中山医院中国中西医结合学会生殖医学不孕不育研究所提供）。

1.3 试 剂 FSH、LH、T、E2放射免疫试剂盒购自上海史瑞可生物技术有限公司；瘦素ELISA试剂盒、OB-R、IGF-IR免疫组化试剂盒及SABC二抗试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 造模及分组 70只SD大鼠随机分为病理模型组57只，正常对照组13只。病理模型组大鼠每天颈背部皮下注射HCG 5U，隔日注射丙酸睾丸酮1.25mg；正常对照组给予生理盐水0.05mL，给药第21天处死正常组大鼠3只和病理模型组大鼠7只评价造模效果。镜下观察正常对照组卵巢组织卵泡数目较少，并可见成熟卵泡和黄体。病理组卵巢组织内均可见多个细小卵泡和闭锁卵泡，无成熟卵泡，提示造模成功。其余60只再随机分为正常对照组、模型组、中药组、达英-35组、达英加中药组、桂枝茯苓丸组，每组10只。

2.2 给 药 中药组给予等效剂量益肾导痰调冲汤23.96 g/（kg·d）灌胃（按人鼠体质量比换算相当于成人用药量的6.25倍），共14天；达英-35组给予等效剂量达英-35 0.21 g/（kg·d）灌胃，共14天；达英加中药组给予益肾导痰调冲汤23.96 g/（kg·d）+达英-35 0.21 g/（kg·d）灌胃（中西药灌胃间隔时间30 min），共14天；桂枝茯苓丸组给予等效剂量桂枝茯苓丸0.42g/（kg·d）灌胃，共14天；正常对照组和模型组均给予同容积生理盐水，共14天。

2.3 标本采集 大鼠处死前禁食水6h，测量大鼠体质量，2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部剪毛，常规消毒，打开胸腹腔，心脏取血，3000 r/min离心，分离血清，-20℃保存。

2.4 检测指标及方法 血FSH、LH、E2、T采用放射免疫法测定；lep采用ELISA法测定；精确切取双侧卵巢，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，采用免疫组化SABC法检测卵巢组织OB-R、IGF-IR表达。结果判断：显色呈棕黄色颗粒为阳性表达。正常对照组和模型组卵巢组织颗粒细胞及卵泡膜细胞均可见OB-R、IGF-IR阳性表达。

2.5 统计学方法 使用SPSS11.5统计软件。所有数据进行正态性检验，用均数±标准差（±s）表示。多组样本均数比较进行方差齐性检验和单因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet,sT3检验。

3 实验结果

3.1 卵巢组织形态学改变 正常对照组卵巢包膜厚薄均一，卵巢内可见窦状卵泡发育及成熟卵泡，个别可见排卵征。模型组卵巢色泽苍白，体积明显增大或缩小，卵巢表面呈明显多囊样改变，包膜明显增厚。卵巢内可见多个细小卵泡发育，未见成熟卵泡及排卵征。中药组、达英-35、达英加中药组、桂枝茯苓丸组大鼠卵巢较模型组色泽红润，体积偶有增大或缩小，卵巢表面偶有多囊样改变。闭锁卵泡数目明显较模型组减少。中药组、桂枝茯苓丸组卵巢内可见窦状卵泡及成熟卵泡，部分可见排卵征，中药组较桂枝茯苓丸组好，接近于正常对照组。达英-35组、达英加中药组无成熟卵泡发育。

3.2 用药前后体质量变化 治疗前各模型组大鼠体质量明显高于正常对照组（P＜0.05）。治疗后，各实验组大鼠体质量均有不同程度增加，中药组、达英-35、达英加中药组、桂枝茯苓丸组大鼠体质量增长幅度明显小于模型组（P＜0.05）；达英加中药组、中药组较达英-35、桂枝茯苓丸组增长幅度小（P＜0.05）。

3.3 各组大鼠血清生殖激素 与正常对照组比较，模型组 LH、LH/FSH、T 明显增高（P＜0.01），FSH、E2明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，用药后各实验组LH、LH/FSH、T 明显降低（P＜0.05或 P＜0.01），E2增高（P＜0.05 或 P＜0.01）。达英加中药组 LH、LH/FSH、T、E2与中药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

3.4 各组大鼠血清lep水平比较 模型组大鼠血清lep水平明显高于正常对照组（P＜0.01）；用药后，中药组、达英-35组、达英加中药组、桂枝茯苓丸组血清lep 水平较模型组显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；中药组、达英加中药组间，达英-35、桂枝茯苓丸组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3.5 卵巢组织OB-R、IGF-IR表达 正常对照组大鼠卵巢颗粒细胞及卵泡膜细胞可见OB-R、IGF-IR表达；模型组OB-R、IGF-IR阳性表达较多，明显高于正常对照组（P＜0.01）；用药后，中药组、达英-35+中药组OB-R、IGF-IR表达较少，明显低于模型组（P＜0.01）；达英-35组、桂枝茯苓丸组亦低于模型组（P＜0.05），但中药组、达英+中药组低于达英-35组和桂枝茯苓丸组（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠生殖激素比较（±s）

表1 各组大鼠生殖激素比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△p＜0.01；与中药组比较，▲P＜0.05

组 别 n/只正常组 10模型组 10 LH/(mIU/mL)24.26±3.67 51.96±4.12**中药组 10 25.11±2.33△△达英-35组 10 42.94±3.57△达英+中药组 10 23.50±2.77△△▲桂枝茯苓丸组 10 39.95±5.89△FSH/(mIU/mL)9.95±4.12 8.98±7.32*10.40±4.33 12.19±6.25 10.98±9.81 17.92±9.72 LH/FSH T/(ng/mL) E2/(pg/mL)1.98±3.26 0.08±0.31 23.25±2.33 6.15±2.27** 1.83±0.38** 10.10±4.27*2.36±1.73△△ 0.14±0.24△△ 20.01±2.09△△3.01±1.78△ 0.15±0.17△ 14.69±3.08△2.28±2.46△△▲ 0.11±0.24△△▲ 20.10±3.98△△▲2.99±3.43△ 0.39±0.68△ 19.96±2.79△

表2 各组大鼠血清lep、OB-R、IGF-IR水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清lep、OB-R、IGF-IR水平比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与达英 -35 组比较，▲P＜0.05；与中药组比较，☆P＜0.05

组 别 n/只正常组 10模型组 10 leptin/(ng/mL)0.83±0.48 4.45±0.48*OB-R 0.80±1.37 10.40±1.37*中药组 10 2.68±0.67△△达英-35组 10 3.34±0.83△5.60±1.45△△6.30±1.40△达英+中药 10 2.49±0.69△△桂枝茯苓丸组 10 3.30±0.89△5.40±1.24△△▲7.20±1.96△☆IGF-IR 0.30±0.67 5.60±0.67*2.30±0.65△△3.20±0.75△2.20±0.64△△▲3.10±0.76△☆

4 讨论

有研究表明[2]，PCOS存在内分泌、代谢障碍以及卵巢组织形态学及其功能异常。下丘脑－垂体－卵巢轴的功能紊乱是PCOS最主要的病理生理变化。Lep调节下丘脑-垂体-卵巢轴的功能，和OB-R、IGF-IR一起在PCOS的发生发展中参与卵泡膜细胞和颗粒细胞的作用，促进卵泡膜细胞合成雄激素，形成PCOS高雄激素血症。鲁海鸥等[3]研究发现，不同原因不孕症中血清Lep水平最高的为卵巢功能障碍，推测Lep主要通过影响PCOS患者的卵巢功能影响生殖。本研究发现，PCOS大鼠血清Lep水平升高（P＜0.01），模型组OB-R、IGF-IR阳性表达率明显增高（P＜0.01）。表明Lep和IGF-IR参与了PCOS的发生发展[4-6]。

程泾教授认为，PCOS的致病机制主要是由于脾肾阳虚，痰湿瘀滞冲任所致。治疗以健脾益肾，化痰祛瘀调冲为基本原则，拟方益肾导痰调冲汤。方中仙灵脾、菟丝子、杞子补肾之力较强，菟丝子[7]水提取物能提高垂体对下丘脑促性腺激素的反应性，具有雌激素样作用，还能促进脂肪分解，对于PCOS肥胖、雄激素过高有一定疗效。三药联用取阴中求阳之意。胆南星、白芥子、法半夏、石菖蒲燥湿化痰，水蛭、海藻、山慈菇化瘀散结，丹参、香附、茺蔚子[8]活血化瘀调经。茺蔚子作为妇科引经药，可引导全方药物直达病所。各药合用，使肾充脾旺，痰瘀之邪尽除，阴平阳秘，气血冲任调和，则月经如期而至，易于摄精成孕。谈珍瑜等[9]研究表明，补肾活血中药可明显降低PCOS大鼠血清Lep和T水平，并具有明显的减肥效应；提示补肾活血中药可阻碍PCOS患者肥胖的发展。本实验的研究结果与以上观点一致。

本实验结果显示，益肾导痰调冲汤可改善PCOS大鼠的全身状况及卵巢的局部功能，降低PCOS大鼠血清LH/FSH比值，降低血清T及Lep水平，增高E2水平，下调OB-R、IGF-IR表达，有助于卵泡的生长发育及优势卵泡的形成，改善PCOS大鼠的高雄激素血症及排卵障碍。

[1]程泾.妇科疑难病现代中医诊断与治疗[M].北京:人民卫生出版社，2003:248.

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[3]鲁海鸥,阎素文,张宁,等.不孕症与血清瘦素水平关系的观察[J]. 人民军医，2002，45（11）:660-661.

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[5]Agarwal SK,Vogel K,Weitsman SR,et al.Leptin antagonizes the Insulin-like growth factor-I augmentation of sieroidogenesis in granμlose and theca cells of the human ovary[J].J Clin Endocrinol Metab 1999,84（3）:1072.

[6]Loffler S,Aust G,Kohler U,et al.Evidence of leptin expresstion in nomal polycystic human ovaries[J].Mol Hum Repord，2001，7（12）:1143-1149.

[7]程泾.妇科疑难病现代中医诊断与治疗[M].北京:人民卫生出版社,2003:118.

[8]雷载权.中药学[M].上海：上海科学技术出版社,1995:84-310.[9]谈珍瑜,邹芝香,尤昭玲,等.补肾活血方对PCO大鼠瘦素、胰岛素和睾酮影响的实验研究[J].新中医，2006，38（12）:87-88.