维生素D3对三硝基苯磺酸诱导的大鼠结肠炎的作用*

谭 蓓 戴张晗 吕 红 王 鸥 杨 红 钱家鸣#

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科1(100730)内分泌科 卫生部内分泌重点实验室2

目前认为炎症性肠病(IBD)是以遗传易感性为基础，环境因素参与，黏膜免疫系统对肠腔内抗原物质(如共生菌)的异常免疫应答而造成的肠道损伤。近年研究发现，除具有调节钙、磷代谢的传统作用外，维生素D(VitD)还具有抗感染和调节免疫的作用［1］。IBD患者普遍存在VitD缺乏，且与病情程度相关［2］，目前两者的关系日渐受到关注。本研究采用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠结肠炎模型，通过给予不同剂量VitD3干预，旨在探讨VitD3对大鼠实验性结肠炎的疗效及其作用机制。

材料与方法

一、实验动物、主要试剂

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，4～8周龄，体质量0.20～0.25 kg，购自北京大学医学部实验动物科学部，于北京协和医院动物中心SPF级实验室饲养。

TNBS、活性 VitD31，25(OH)2D3购自 Sigma 公司;5-氨基水杨酸(5-ASA)为德国Dr.Falk Pharma GmbH生产的美沙拉嗪灌肠液;VitD3(商品名:英康利)购自上海信谊金朱药业有限公司。髓过氧化物酶(MPO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒、Quant cDNA第一链合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix均购自天根生化科技(北京)有限公司。

二、研究方法

1.结肠炎模型的建立和药物干预:将大鼠随机分为11组，每组各6只。根据Morris等［3］的方法，将TNBS 100 mg/kg溶于50%乙醇溶液0.25 mL后灌肠各组大鼠(除外空白对照组)，以制备结肠炎模型。造模24 h后开始药物干预，具体方法见表1。造模第10 d处死大鼠，心脏取血和采集结肠组织。

2.结肠炎病情评估:每日观察大鼠体质量变化、大便性状和隐血等情况，行疾病活动指数(DAI)评分［4］。取距肛门3 cm至回盲部的结肠，行大体损伤评分［5］。取距肛门4～5 cm结肠组织，4%甲醛固定，行HE染色，评估组织病理学评分［6］。取距肛门3～4 cm结肠组织，以0.9%NaCl溶液混合后匀浆，按照试剂盒说明书检测MPO活性。

3.RT-PCR 检测T-bet、GATA-3 mRNA 表达:取距肛门5 cm起的结肠组织约20 mg，提取结肠组织总RNA，逆转录酶逆转录为 cDNA，行PCR扩增。各目的基因引物序列［7］见表2，均由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。PCR反应体系25μL，反应条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，各自退火温度退火30 s，72℃延伸1 min，共45个循环;72℃延伸5 min。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Quantity One软件分析各条带平均灰度值，比较目的条带与内参照条带比值，行半定量分析。

表1 各组大鼠药物干预情况

表2 目的基因引物序列、扩增片段和退火温度

4.不良反应监测:心脏取血5 mL，离心分离血清，采用日本Olympus AU-5400全自动生化仪测定钙和肌酐水平。

三、统计学分析

应用SPSS19.0统计软件。计量资料以¯x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，若存在统计学意义，进一步两两比较应用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、结肠炎模型

造模后大鼠均出现腹泻、血便、体质量减轻等症状;可见肠壁增厚、充血糜烂、活动期溃疡，甚至肠腔狭窄、透壁性溃疡、与周围组织黏连等;结肠上皮层局部黏膜缺失，固有层腺体破坏，黏膜下层大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润(见图1)。与空白对照组相比，TNBS组DAI评分、大体损伤评分、组织病理学评分和MPO活性均明显升高(P＜0.001)(见表3)。

表3 各组大鼠DAI、大体损伤和组织病理学评分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表达±s)

表3 各组大鼠DAI、大体损伤和组织病理学评分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表达±s)

*与空白对照组比较，P＜0.001;#与TNBS组比较，P＜0.05;▲与5-ASA组比较，P＜0.05

组 别 例数 DAI评分 大体损伤评分GATA-3 0 0.02±0.02 0 0.38±0.15 TNBS组 6 3.40±0.56* 7.83±2.04* 4.00±0.71* 0.52±0.09* 0.07±0.18 0.37±0.14 5-ASA组 6 3.00±0.77 5.67±1.63 2.58±0.49# 0.15±0.06# 0 0.55±0.15#常规剂量VitD3组 6 2.82±1.52 7.33±1.75 3.08±1.11 0.13±0.03# 0.05±0.06 0.38±0.11常规剂量VitD3+5-ASA组 6 2.38±1.42 6.50±4.28 2.83±1.60 0.12±0.04# 0.08±0.12 0.38±0.19单次大剂量VitD3组 6 2.43±1.23 6.67±1.63 3.42±0.97 0.10±0.03# 0 0.46±0.18单次大剂量VitD3+5-ASA组 6 2.00±0.91 3.40±2.88# 2.10±1.02# 0.11±0.01# 0 0.22±0.06连续大剂量VitD3组 6 2.98±1.28 7.00±2.00 3.42±0.86 0.24±0.12# 0 0.56±0.12#连续大剂量VitD3+5-ASA组 6 2.33±2.00 3.17±3.19# 1.00±1.38#▲ 0.12±0.05# 0 0.48±0.14活性VitD3组 6 2.35±0.97 6.17±3.43 2.92±1.24 0.26±0.13# 0.05±0.08 0.32±0.17活性VitD3+5-ASA组 6 3.27±1.09 6.83±3.19 3.17±1.37 0.21±0.14#mRNA空白对照组组织病理学评分MPO活性(U/g组织)T-bet mRNA 6 0 0 0.03±0.07 0.43±0.21

二、药物干预对结肠炎的影响

各药物干预组结肠壁充血、溃疡、狭窄、黏连以及结肠上皮黏膜缺失、细胞浸润等情况均较TNBS组有所减轻(见图1)。与TNBS组相比，各药物干预组DAI评分虽下降，但差异无统计学意义(P＞0.05);单次大剂量VitD3+5-ASA组、连续大剂量VitD3+5-ASA组大体损伤评分明显下降(P=0.007和P=0.003);5-ASA组、单次大剂量VitD3+5-ASA组和连续大剂量VitD3+5-ASA组组织病理学评分明显下降(P=0.026、P=0.005和P＜0.001);各药物干预组MPO活性均明显下降(P＜0.001)。联合5-ASA后，各组DAI、大体损伤评分、组织病理学评分和MPO活性与5-ASA组相比均无明显差异(P＞0.05)，连续大剂量VitD3+5-ASA组组织病理学评分较5-ASA组明显下降(P=0.013)(见表3)。

图1 各组大鼠结肠组织病理(HE染色 ×100)

三、T-bet、GATA-3 mRNA 表达

1.T-bet mRNA表达:T-bet在空白对照组无表达，TNBS组表达较弱，两组相比差异无统计学意义(P=0.101)。各药物干预组T-bet mRNA表达与TNBS组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，其中5-ASA组、单次大剂量VitD3组、单次大剂量VitD3+5-ASA组、连续大剂量VitD3组、连续大剂量VitD3+5-ASA组表达均缺失(见表3、图2)。

2.GATA-3 mRNA表达:与空白对照组相比，TNBS组GATA-3 mRNA表达无明显差异(P=0.838)。与TNBS组相比，5-ASA组(P=0.037)、连续大剂量VitD3组(P=0.035)表达明显升高，其余药物干预组无明显差异(见表3、图2)。

图2 各组大鼠结肠组织T-bet、GATA-3 mRNA表达的电泳图

四、不良反应监测

连续大剂量 VitD3组、连续大剂量 VitD3+5-ASA组大鼠出现高钙血症，血钙水平明显高于其余各组(P＜0.05)。所有组别大鼠肌酐水平均在正常范围内［8］，但连续大剂量 VitD3组血肌酐水平明显高于其余各组(P＜0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠血钙和血肌酐水平±s)

表4 各组大鼠血钙和血肌酐水平±s)

†与连续大剂量VitD3组比较，P＜0.05;※与连续大剂量 VitD3+5-ASA组比较，P＜0.05

组 别 例数 血钙(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白对照组 6 2.58±0.95†※ 22.60±2.07†TNBS组 6 2.59±0.12†※ 20.00±6.92†5-ASA 组 6 2.63±0.08†※ 21.72±3.24†常规剂量 VitD3组 6 2.48 ±0.17†※ 18.77±2.89†常规剂量VitD3+5-ASA组 6 2.40±0.16†※ 21.55±7.84†单次大剂量VitD3组 6 2.66±0.12†※ 19.28±3.26†单次大剂量VitD3+5-ASA组 6 2.44±0.05†※ 17.70±1.67†连续大剂量VitD3组 6 3.36±0.30 28.82±10.61连续大剂量VitD3+5-ASA组 6 3.15±0.30 21.95±7.05†活性 VitD3组 6 2.62 ±0.15†※ 22.18±3.42†活性VitD3+5-ASA组 6 2.61±0.23†※ 21.93±4.64†

讨 论

1989年Morris等［3］首次提出以TNBS法制备大鼠结肠炎模型，TNBS是一种半抗原物质，在乙醇破坏肠黏膜屏障后，与肠黏膜角蛋白结合成为全抗原，激发局部免疫反应，造成与人类IBD相似的实验性结肠炎。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒中的酶之一，与急性炎症的严重程度呈正相关。本研究以TNBS诱导后大鼠均出现腹泻、血便、体质量下降，结肠壁增厚、充血糜烂和溃疡，并伴有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，大体损伤评分和组织病理学评分、MPO活性均明显升高，表明TNBS成功诱导了实验性结肠炎。

目前VitD3的推荐剂量主要针对普通人群预防和治疗骨质疏松，尚缺乏VitD3对IBD患者起免疫调节作用所需剂量的相关数据。因此，本研究采用常规剂量、单次大剂量和连续大剂量VitD3三种不同剂量梯度以观察大鼠炎症改善情况。结果显示不同剂量VitD3干预组MPO活性均较TNBS组明显下降，表明VitD3可减轻肠道中性粒细胞浸润的急性炎症。其中单次或连续大剂量VitD3联合5-ASA的疗效较常规剂量VitD3更为突出，表现为大体损伤和组织病理学评分较TNBS组明显减轻，而常规剂量VitD3组与TNBS无明显差异。然而随着VitD3剂量增加，不良反应亦增多，连续大剂量VitD3导致血钙和血肌酐水平均明显升高。目前有研究［9，10］应用VitD3类似物治疗IBD，均取得良好的疗效，为将来增加VitD3治疗剂量提供了一定依据。

传统上将CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞，其分化受转录因子影响。T-bet是Th1型免疫的关键调节因子［11］，GATA-3是一种锌指蛋白，为Th2的关键调节因子［12］。Th1/Th2细胞比例失衡在IBD发病中起重要作用。TNBS诱导的实验性结肠炎以Th1为主，类似于人类克罗恩病(CD)，抑制T-bet表达而上调GATA-3表达可影响T细胞从Th1细胞向Th2细胞的分化。有研究发现VitD3具有免疫调节作用，Daniel等［13］发现活性 VitD3和活性 VitD3+地塞米松组中GATA-3表达分别是TNBS实验性结肠炎小鼠的2倍和5倍，且活性VitD3联合地塞米松较单用地塞米松可明显下调T-bet。本研究中，空白对照组不表达T-bet，TNBS组弱表达，符合TNBS诱导的实验性结肠炎以Th1为主，单次或连续大剂量VitD3联合5-ASA均可使 T-bet表达缺失，同时5-ASA、连续大剂量VitD3可上调 GATA-3表达，因此考虑VitD3可能通过Th1/Th2平衡调节T细胞免疫。

本研究中，活性VitD3组补充的1，25(OH)2D3仅为常规剂量，其对大鼠大体、组织学和T细胞免疫均未表现出明显的治疗作用。因而，考虑VitD3所表现出的减轻炎症作用与剂量而非剂型相关，活性VitD3价格相对昂贵，临床上可选择普通VitD3并适当增加补充剂量。

本研究中，应用5-ASA虽在T细胞免疫和组织学评估中表现出一定治疗效果，但并未能使大体损伤较TNBS组明显减轻，与临床上5-ASA治疗CD的效果相一致。而5-ASA联合大剂量VitD3后，大鼠结肠炎组织病理学进一步减轻，提示在IBD临床治疗中辅以中-高剂量VitD3或许能提高传统药物的治疗效果，起较好的协同作用。

此外，本研究中TNBS组大体损伤和组织病理学评分均明显高于空白对照组，但T-bet和GATA-3 mRNA表达与空白对照组无明显差异，原因可能为大鼠于造模后第10 d处死时，其实验性结肠炎已趋于慢性化且存在自愈趋势，故炎性因子水平已有所下降，但组织学修复需一定过程，故迟于炎性因子变化。

综上所述，VitD3可减轻TNBS诱导的实验性结肠炎急性炎症，单次和连续大剂量VitD3联合5-ASA可进一步明显减轻大体损伤和组织病理学炎症，单次或连续大剂量VitD3及其联合5-ASA可下调T-bet表达，5-ASA和连续大剂量 VitD3上调 GATA-3表达，但VitD3剂量过大会引发高钙血症和肌酐升高。说明VitD3可通过调节T细胞免疫减轻TNBS诱导的实验性结肠炎，但具体机制仍有待进一步研究证实，并控制不良反应的发生。

1 Raftery T，O’Morain C，O’Sullivan M.Vitamin D:New roles and therapeutic potential in inflammatory bowel disease［J］.Curr Drug Metab，2012 ［Epub ahead of print］.

2 Leslie WD，Miller N，Rogala L，et al.Vitamin D status and bone density in recently diagnosed inflammatory bowel disease:the Manitoba IBD Cohort Study［J］.Am J Gastroenterol，2008，103(6):1451-1459.

3 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］.Gastroenterology，1989，96(3):795-803.

4 Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B(p65)antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis［J］.Clin Exp Immunol，2000，120(1):51-58.

5 Wallace JL，Keenan CM.An orally active inhibitor of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis［J］.Am J Physiol，1990，258(4 Pt 1):G527-G534.

6 Sykes AP，Bhogal R，Brampton C，et al.The effect of an inhibitor of matrix metalloproteinases on colonic inflammation in a trinitrobenzenesulphonic acid rat model of inflammatory bowel disease［J］.Aliment Pharmacol Ther，1999，13(11):1535-1542.

7 陈冬，李玉晓，李添应，等.大蒜新素对变应性鼻炎大鼠转录因子T-bet和GATA-3表达的影响［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，45(2):133-138.

8 林健，郑丽红，陈润，等.SD大鼠血液生化指标正常参考值范围的探讨［J］.医学动物防制，2005，21(5):321-322.

9 Daniel C，Radeke HH，Sartory NA，et al.The new low calcemic vitamin D analog 22-ene-25-oxa-vitamin D prominently ameliorates T helper cell type 1-mediated colitis in mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(2):622-631.

10 Stio M，Martinesi M，Bruni S，et al.Interaction among vitamin D(3)analogue KH 1060，TNF-alpha，and vitamin D receptor protein in peripheral blood mononuclear cells of inflammatory bowel disease patients［J］.Int Immunopharmacol，2006，6(7):1083-1092.

11 Peng SL.The T-box transcription factor T-bet in immunity and autoimmunity［J］.Cell Mol Immunol，2006，3(2):87-95.

12 Ray A，Cohn L.Th2 cells and GATA-3 in asthma:new insights into the regulation of airway inflammation［J］.J Clin Invest，1999，104(8):985-993.

13 Daniel C，Sartory NA，Zahn N，et al.Immune modulatory treatment of trinitrobenzene sulfonic acid colitis with calcitriol is associated with a change of a T helper(Th)1/Th17 to a Th2 and regulatory T cell profile［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324(1):23-33.