丁香酚在大鼠体内的组织分布研究

李婷婷，陈蓉，曾文婷，赵雪，张斌，杨书（.成都医学院药学院，成都60083；.成都市363医院药剂科，成都 60083；3.成都医学院公共卫生系，成都 60083）

丁香酚（C10H12O2，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子量为164.20），广泛存在于丁香油、肉桂叶油、樟脑油等芳香油中，是丁香和丁香罗勒油的主要成分[1]。近年来对丁香酚的药理作用和可能的相关机制研究都取得了一定进展。研究表明，丁香酚具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗过敏、麻醉[2～5]等广泛的药理活性。本课题组对丁香酚在大鼠体内的药动学进行了研究，建立了其在大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，观察经单剂量给药后在大鼠体内4个时间点和主要脏器中的分布经时变化。

1 仪器与材料

1.1 仪器

U-3000 HPLC仪，包括P680型高压泵、ASI-100型自动进样器、UVD170U型多波长紫外检测器、真空脱气机、自动进样器（美国Agilent公司）；CP225D型电子天平（美国Sartorius公司）；TGL-16型台式离心机（上海市安亭科学仪器厂）；XW-80A型涡旋混合仪（上海青浦沪西仪器厂）；移液器（20～200 μL，美国Hamilton公司）。

1.2 试药

丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：A0074）；肉桂酸标准品（国药集团化学试剂有限公司，批号：A0305，纯度≥98%）；甲醇（英国Dikma公司，批号：93102）；乙醇（成都市科伦化学试剂厂，批号：20090725）；冰醋酸、氢氧化钠（天津市致远化学试剂有限公司）；水为实验室自制超纯水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康SD大鼠24只，♂，体重（200±20）g，由四川大学实验动物中心提供（动物使用合格证号：34动管122号）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Allsphere ODS-2 RP-18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.5%冰醋酸（63∶37，V/V，pH 3.80）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.2 组织样品预处理

取大鼠组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺），于生理盐水中去除粘连组织，剪碎、称重后按所取组织重量加入3倍体积的生理盐水，于玻璃组织匀浆器中匀浆，精密量取大鼠组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺）匀浆液0.5 mL，置于4 mL离心管中，加入内标肉桂酸25 μL，涡旋混匀30 s，混匀后加入甲醇1 mL，继续涡旋混匀3 min，12 000 r·min-1离心3 min，取上层清液，在“2.1”项下色谱条件下测定，记录内标峰面积和丁香酚峰面积，代入标准曲线计算大鼠组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺）中丁香酚的浓度。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取丁香酚对照品适量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容制备成浓度为68.672 μg·mL-1的贮备液，经稀释，配制成浓度为 0.537、1.074 5、2.167、4.292、8.584、17.168、34.336 μg·mL-1的对照品溶液，于0～4 ℃贮藏，备用。

2.3.2 内标溶液的制备 精密称取肉桂酸标准品适量，置于25 mL容量瓶中，制备成浓度为31.80 μg·mL-1的甲醇稀释液，即得到内标溶液，于0～4℃贮藏，备用。

2.3.3 丁香酚给药液的制备 精密称取丁香酚对照品适量，加入70%乙醇-聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）溶液充分溶解后稀释，配制浓度为2.26 mg·mL-1的丁香酚给药溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备 精密量取大鼠组织样品匀浆液（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺）0.5 mL，置于离心管中，依次加入不同浓度的丁香酚对照品溶液25 μL，涡旋混匀30 s，分别得浓度为 2.158、1.078、0.539、0.279、0.139、0.054、0.011 μg·mL-1含药试样，按“2.2”项下从“加入内标肉桂酸”开始操作。测定组织样品匀浆中内标峰面积（Ais）和样品丁香酚的峰面积（Aa）。以Aa与Ais的比值（A）为纵坐标，浓度c（µg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，得大鼠各组织中标准曲线和相关系数，详见表1。

表1 大鼠各组织中标准曲线和相关系数Tab 1 Standard curves and correlation coefficients of eugenol in each organ

2.4.2 专属性试验 取空白胃组织样品加丁香酚和内标物肉桂酸，按“2.2”项下方法处理后照“2.1”项下色谱条件分别进样测定。结果表明，各组织中的内源性物质对测定结果无影响，丁香酚的保留时间约为9.7 min，内标物肉桂酸的保留时间约为7.6 min，两者峰形良好，基线平稳。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白胃样品；B：空白胃样品+丁香酚（0.279 μg·mL-1）+内标（0.135 μg·mL-1）；C.给药后60 min的胃样品+内标；1.内标；2.丁香酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank stomach homogenates；B.blank stomach homogenates+eugenol（0.279 μg·mL-1）+IS（0.135 μg·mL-1）；C.stomach homogenate 60 min after administration+IS；1.IS；2.eugenol

2.4.3 最低定量浓度的确定 配制一系列不同浓度的丁香酚溶液，按“2.2”项下方法测定样品峰面积。结果表明，丁香酚组织匀浆液浓度在0.011～2.158 μg·mL-1范围内，与峰面积比值呈良好线性关系，故确定丁香酚组织样品匀浆液最低定量浓度为 0.011 μg·mL-1。

2.4.4 方法回收率试验 取不同浓度丁香酚对照品溶液各25 μL，加入0.5 mL空白组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺）匀浆液中，配制高、中、低浓度的含药组织样品匀浆液，按“2.2”项下从“加入内标肉桂酸”开始操作，以测得值与加入量的比值计算回收率。结果，回收率在（83.35±3.37）%～（105.21±5.49）%范围之间，表明该法可用于测定大鼠组织中目标化合物的浓度。

2.4.5 精密度试验 取丁香酚高、中、低浓度的组织样品各6份，每一浓度进行6样本分析，按“2.4.4”项下方法测定，以同日内5次测定结果计算日内精密度，以1周内3 d测定结果计算日间精密度。结果表明，本方法测定的丁香酚组织样品的日内和日间精密度RSD均＜15%，符合规定。

2.4.6 绝对回收率试验 取丁香酚高、中、低浓度的组织样品各3份，按“2.2”项下方法操作，测得样品中被测物的色谱峰面积，与相应浓度的对照品溶液中被测物的色谱峰面积比较，计算绝对回收率。结果，被测物和内标在高、中、低浓度组织样品中绝对回收率均＞60%，表明组织样品的萃取方法稳定可靠。

2.4.7 组织样品稳定性试验 取丁香酚组织样品高、低浓度各3份，于（20±2）℃下保存10 h后测定，考察组织样品的短期稳定性；取组织样品高、低浓度各3份，制备12 h后测定，考察组织样品的制备后稳定性；取组织样品高、低浓度各3份，冷冻贮藏于－20℃，在室温中充分解冻，然后再次冷冻，重复3个冻融周期后测定，考察组织样品的3周期冻融稳定性。结果，RSD均＜15%，表明组织中的被测物稳定，其浓度可以被准确测定。

2.5 组织分布研究

2.5.1 组织样品的处理与预处理 选取SD大鼠，随机均分为4组，每组6只，ig丁香酚给药液，0.25 mL/只。4组大鼠分别于给药后40 min和2、4、6 h断颈处死，取出心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、脑、前列腺，称重，按各组织的重量加入3倍体积的生理盐水，在玻璃组织匀浆器中分别制成各组织匀浆，所得匀浆液于－20℃贮藏，备用。

2.5.2 组织样品分布研究 大鼠ig丁香酚后，考察其在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、脑、前列腺组织中不同时间点的分布经时变化。大鼠各组织中不同时间点药物浓度见表2；ig丁香酚后大鼠各组织中待测化合物的平均药物浓度分布曲线见图2。

表2 大鼠各组织中不同时间点药物浓度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

表2 大鼠各组织中不同时间点药物浓度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

组织 时间点/min心肝脾肺脑肾胃前列腺大肠小肠40 1.990 1±0.072 4 4.792 1±0.154 8 9.973 1±0.312 7 8.920 7±0.413 5 3.232 8±0.117 2 5.536 5±0.183 0 3.790 8±0.099 8 1.200 8±0.058 0 9.591 3±0.428 0 7.381 7±0.207 4 120 2.677 2±0.088 5 9.040 3±0.276 2 12.181 1±0.479 0 11.331 2±0.591 0 3.588 7±0.168 4 10.113 4±0.295 6 9.124 5±0.331 0 1.487 3±0.074 5 13.680 3±0.446 0 13.403 5±0.370 0 240 1.404 1±0.046 5 2.833 0±0.095 7 4.736 9±0.122 6 4.431 7±0.211 2 2.039 8±0.087 5 2.609 5±0.088 4 2.392 9±0.058 0 0.973 1±0.040 4 5.440 8±0.154 7 3.041 2±0.100 9 360 0.823 1±0.033 7 0.516 1±0.019 7 1.061 8±0.032 6 0.932 9±0.041 8 0.467 5±0.018 0 0.575 0±0.016 5 0.915 2±0.025 0 0.332 9±0.017 8 0.690 6±0.014 2 1.422 4±0.057 4

3 讨论

图2 ig丁香酚后大鼠各组织中待测化合物的平均药物浓度分布曲线图（n＝6）Fig 2 Average concentration curves of measured compound in rat tissues after intragastical administration of eugenol（n＝6）

药物体内分布是指药物从全身循环转运到各器官、组织的过程。药物进入体循环后分布于全身各组织，由于器官之间的血液灌注存在差异，药物与组织结合力不同等因素的影响，导致药物分布一般是不均匀的。组织分布研究的重要性不亚于血浆药物浓度研究，虽然对人体组织直接测量药物的含量存在很大困难，现阶段却可以利用实验动物获得的数据借助数学模型推导出在人体内的分布参数，为药物的有效性和毒副作用作出合理的解释[6]。

本研究采用ig给药的方式，初步研究丁香酚在大鼠体内心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、大肠、小肠、前列腺中的分布规律，完善丁香酚药动学研究。虽然前列腺不是主要的药物代谢器官，但选择它是为丁香酚对前列腺增生的抑制作用的研究提供基础依据。结果表明，给药后丁香酚能较快分布到各组织中，分布范围较广，其中在肠、脾水平相对较高，脑中则较低。根据不同时间的采样点所得样品相互比较，可见120 min采样点各组织中的丁香酚含量基本都高于其他几个采样点的含量，随后，采样时间越长，丁香酚含量呈逐渐降低的趋势。总之，本试验可为丁香酚的进一步研究提供理论依据。

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