大黄素固体脂质纳米粒在小鼠体内的组织分布研究

张 洪，闫士君，张福明（武汉大学人民医院药学部，武汉 430060）

大黄素（EMO）是我国传统中药大黄的主要有效成分，其化学名为1，3，8-三羟基-6甲基蒽醌（1，3，6-trihydroxy-6methy lanthraquinone），分子量为270.23。目前国内、外很多学者对其作了深入研究，发现具有广泛的药理作用，不仅具有抗炎、调节脂代谢、保护肝肾功能，而且对肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤具有明显的抑制作用[1，2]。

固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是20世纪末期兴起的一种新型纳米载药系统，不仅具备物理稳定性高、良好靶向性和能增加药物稳定性的优点，还具有脂质体毒性低、可大规模生产的优势[3，4]，近年来已成为药剂学科中的研究热点。笔者采用实验室制备好的大黄素固体脂质纳米粒（EMO-SLN），通过iv给药，研究其在小鼠体内的组织分布特点，进行EMO-SLN的靶向性探讨，为其临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

P680型分析型高效液相色谱（HPLC）仪（美国戴安公司）；XW-80型涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；3K30型冷冻高速离心机（美国Sigma公司）；BF2000型水浴氮气挥干仪（北京八方实验仪器有限公司）；AG245型电子天平（德国Mettler Toledo公司）；玻璃匀浆器（武汉凯博仪器公司）。

1.2 试药

EMO原料药（宝鸡市方晟生物开发有限公司，批号：080726）；EMO对照品（中国食品药品检定研究院，批号：0753-8902）；EMO-SLN（武汉大学人民医院药学部自制）；肝素钠注射液（天津市生物化学制药厂）；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

SPF级昆明种小鼠132只，♀♂兼半，体重（200±20）g，由武汉大学人民医院实验动物中心提供（动物生产许可证号：SYXK（鄂）2004-002）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取EMO对照品3 mg，用甲醇定容至100 mL，配成浓度为30 μg·mL-1的溶液，从中精密量取1、2、5、10 mL，分别置于100 mL容量瓶中，精密量取此溶液2、5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成浓度分别为0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15.0 μg·mL-1的系列对照品溶液。

2.2 生物样品的采集和处理

取健康小鼠60只，随机分成2组，实验前禁食12 h，分别iv EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬（剂量均为10 mg·kg-1），于给药后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、6.000 h脱臼处死小鼠，取小鼠心、肝、脾、肺、肾各组织样品，用生理盐水冲净表面血液和内容物后，精密称定，加入2倍量的生理盐水研磨成匀浆。精密量取血浆或匀浆100 μL，置于5 mL的离心管中，加入30%H2SO4100 μL，涡旋混合30 s，70 ℃水浴30 min，水解30 min，冷却至室温。加入乙醚1 mL，涡旋混合提取3 min，3 000 r·min-1离心5 min，转移上清液至5 mL离心管中。下层水相依法用乙醚萃取1次，合并乙醚液，于40℃氮气下吹干，残余物用100 μL 甲醇溶解，涡旋混合 3 min，12 000 r·min-1离心 10 min，取上清液20 μL进样，记录色谱图和峰面积。

2.3 EMO小鼠体内分析方法的建立

2.3.1 色谱条件[5]色谱柱：ASM-Kromasil-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（90∶10）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：20 μL；柱温：40 ℃。

2.3.2 方法的专属性试验 取空白血浆和组织匀浆给药后收集的血浆和匀浆样品，按“2.2”项下方法操作，照上述色谱条件进样20 μL，测定。结果表明，在选定的条件下，EMO与内源性物质分离良好，且在样品处理过程中未引入干扰性物质，方法的专属性良好。小鼠组织匀浆样品的HPLC见图1。

2.3.3 标准曲线的制备 取空白血浆或空白组织匀浆100 μL，置于5 mL离心管中，加系列对照品溶液使之成为相当于血浆或组织匀浆浓度0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15.0 μg·mL-1的样品，按照“2.2”项下方法操作。以待测物浓度（c）为横坐标，对照品峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得血浆和各组织匀浆的回归方程。结果表明，EMO检测浓度在0.3～15.0 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。EMO在小鼠组织匀浆和血浆中的回归方程见表1。

2.3.4 精密度试验 分别取空白血浆和组织匀浆100 μL，加入不同浓度EMO对照品溶液，涡旋混合3 min，制成高、中、低浓度EMO血浆样品，各浓度制备3个样本，按“2.2”项下方法操作，日内和日间精密度试验各重复5次，计算精密度。结果，日内、日间精密度的RSD均＜15%，符合生物样品分析要求。精密度试验结果见表2。

2.3.5 方法回收率试验 精密吸取适量3种浓度的EMO对照品溶液，加到100 μL空白血浆和组织匀浆中，涡旋混合3 min，制成高、中、低浓度生物样品，每一浓度分别制备3个样本。按“2.2”项下方法操作，记录峰面积，将其代入回归方程计算测得的浓度，以测得浓度与实际加入浓度之比计算方法回收率，结果见表3。

2.3.6 提取回收率试验 精密吸取适量的3种浓度的EMO对照品溶液适量，加到100 μL空白血浆和组织匀浆中，涡旋混合3 min，制成高、中、低浓度的血浆样品，每一浓度分别制备3个样本。按“2.2”项下方法操作，记录样品峰面积，将样品峰面积与空白峰面积相除即得提取回收率，结果见表4。

由表3、表4可知，RSD均＜15%，方法重现性较好。说明所采用的分析方法符合生物样品分析要求，可用于提取小鼠组织和血浆样品中EMO。

2.4 实验方案

2.4.1 小鼠体内组织分布实验 将72只昆明种小鼠随机分成对照组与制剂组，每组再分成6个时间点，每个时间点6只。以用EMO对照品溶液的一组作为对照组，用EMO-SLN混悬液为制剂组。禁食12 h后，尾iv给药，剂量为10 mg·kg-1。分别于给药后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、6.000 h摘眼球取血，加肝素抗凝，4 000 r·min-1离心10 min分离血浆，然后将小鼠颈椎脱臼处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾，用生理盐水洗净各组织表面的残血，并用滤纸将水分吸干，于－20℃下贮藏，待用[6]。

取100 μL小鼠组织匀浆和血浆，按“2.2”项下方法操作，测定不同时间点尾ivEMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液后，小鼠血浆和各组织中的EMO浓度。小鼠尾iv EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液后的药物浓度比较见表5（表中a为EMO对照品溶液；b为EMO-SLN混悬液）。

2.4.2 小鼠体内单点浓度的横向比较 为了直观地比较小鼠尾iv EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液后EMO在不同组织中的分布情况，以尾iv 0.250 h后为例绘制小鼠各组织中EMO平均浓度直方图。小鼠尾iv EMO对照品溶液和EMOSLN混悬液0.25 h的组织分布见图2。

由图2可知，小鼠iv EMO-SLN混悬液和EMO对照品溶液后，药物在肝脏中的浓度最高，其次是血浆、肺和心，而在脾、肾中浓度最低。为进一步说明EMO-SLN混悬液对EMO在小鼠体内分布的改变特征，笔者还对实验所得数据进行了定量处理，利用3p97软件对数据进行拟和，通过软件得出各组织的AUC。

图1 小鼠组织匀浆样品的HPLC图A1.心空白匀浆；A2.注射EMO-SLN后心匀浆样品；B1.肝空白匀浆；B2.注射EMO-SLN后肝匀浆样品；C1.脾空白匀浆；C2.注射EMO-SLN后脾匀浆样品；D1.肺空白匀浆；D2.注射EMO-SLN后肺匀浆样品；E1.肾空白匀浆；E2.注射EMO-SLN后肾匀浆样品；F1.空白血浆；F2.注射EMO-SLN后血浆样品Fig 1 HPLC chromatograms of EMO in homogenate sample of mouse tissnesA1.heart blank homogenate；A2.heart homogenate sample after EMOSLN injection；B1.liver blank homogenate；B2.liver homogenate sample after EMO-SLN injection；C1.spleen blank homogenate；C2.spleen homogenate sample after EMO-SLN injection；D1.lung blank homogenate；D2.lung homogenate sample after EMO-SLN injection；E1.kidney blank homogenate；E2.kidney homogenate sample after EMO-SLN injection；F1.blank plasma；F2.plasma sample after EMO-SLN injection

表1 EMO在小鼠组织匀浆和血浆中的回归方程Tab 1 Regression equation of EMO in different mouse tissue homogenates and plasma

表2 精密度试验结果（n＝3）Tab 2Results of precision test（n＝3）

表3 方法回收率试验结果Tab 3 Results of methodology recovery test

表4 提取回收率试验结果Tab 4 Results of extraction recovery test

表5 小鼠尾iv EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液后的药物浓度比较Tab 5 Comparison of the concentrations of EMO after i.v.injection of EMO control solution and EMO-SLN suspension in mice

图2 小鼠尾iv EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液0.25 h的组织分布图Fig 2 Tissue distribution of EMO 0.25 h after i.v.injection of EMO control solution and EMO-SLN suspension in mice

2.4.3 EMO-SLN混悬液靶向性评价 根据参考文献[7]，综合选用靶向性参数：总靶向效率摄取率（re）、总靶向性（Te）来进行评价。其中：re＝AUCn/AUCs，Te＝AUC靶/AUC总，式中n和s分别表示混悬液和溶液。EMO对照品溶液、EMO-SLN混悬液的靶向性参数比较结果见表6。

表6 EMO对照品溶液、EMO-SLN混悬液的靶向性参数比较结果Tab 6 Comparison of target parameters of EMO control solution and EMO-SLN suspension

由表6可知，小鼠尾iv EMO-SLN混悬液后，肝脏和脾脏的re分别是4.139和2.194，肝脏的Te也远远高于其它各器官，达到了57.99%，这说明小鼠经尾iv EMO-SLN混悬液后，其肝脏靶向明显，药物浓集于肝脏中。

3 讨论

SLN的体内分析方法很多，本文采用HPLC法测定EMO在组织的分布，简单可行，在所选用的色谱条件下，样品内源性物质不干扰EMO的测定，测定结果较好。将EMO制成SLN后改变了其在小鼠组织的分布，肝脏的靶向性明显增强，肝脏re和总靶向性都明显增强。这使其有望用于肝癌、肝纤维化的治疗。

本研究中涡旋提取是很重要的步骤，生物样本的提取中出现了多次涡旋过程。组织匀浆样本比血浆样品黏稠，为了提高涡旋效率，提高提取回收率，故选用了功率较大的涡旋仪，涡旋较长时间，尽可能使其混合均匀，使液-液萃取的效率提高。

从小鼠体内分布研究可以看出，小鼠尾iv给予相同剂量的EMO对照品溶液和EMO-SLN混悬液后不同时间里，药物在血浆、心、肝、脾、肺、肾分布呈现出不同程度的差异。通过比较各器官的re、Te可知，EMO-SLN在肝脏、脾脏的浓度最高。

本研究表明，与EMO对照品溶液比较，EMO-SLN混悬液可在组织中较长时间保持较高浓度，消除较慢，更利于维持稳态血药浓度。

[1]Shieh DE，Chen YY，Yen MH，et al.Emodin-induced apoptosis through p53-dependent pathway in human hepatoma cells[J].Life Sci，2004，74（18）：2 279.

[2]Cha TL，Qiu L，Chen CT，et al.Emodin down-regulates androgen receptor and inhibits prostate cancer cell growth[J].Cancer Res，2005，65（15）：2 287.

[3]Muller RH，Mader K，Gohla S.Solid lipid nanoparticles（SLN）for controlled drug delivery-a review of the state of the art[J].Eur J Pharm Biopharm，2000，50（1）：161.

[4]Mehnert W，Mader K.Solid lipid nanoparticles：production，characterization and applications[J].Adv Drug Deliver Rev，2001，47（2）：165.

[5]陈力奋，袁国平.反相高效液相色谱法测定联苯双酯及其滴丸的含量[J].海峡药学，2006，18（4）：85.

[6]张 洪，成 蓓.联苯双酯固体脂质纳米粒在小鼠体内组织分布的研究[J].中国药房，2009，20（22）：1718.

[7]毕殿洲.药剂学[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2000：450.