黏细菌93431次级代谢产物的分离纯化及活性测定

刘 斌，王鸿鹏，陈 川，张利平，石 楠，汤 辉，郭立格

(河北大学生命科学学院，河北保定071002)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新诊断乳腺癌≥120万例［1～3］。乳腺癌给患者带来了巨大的痛苦。寻找治疗乳腺癌的特效药物一直是新药研发的热点。黏细菌是一类单细胞［4］、长杆状［5］、可滑行运动［6］的革兰阴性菌，在系统分类上属于紫细菌类群的δ分支，共12个属约40个种［7］。黏细菌以二等分分裂繁殖，大多生长在土壤中或食草动物的粪便上，有的能分解纤维素［8］。黏细菌具有产生活性物质种类多、结构新且菌株差异大的特点［2，3］。黏细菌能产生种类众多的次级代谢产物，其中相当一部分代谢物具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤等生物活性［9］，而且作用机制多种多样，目前已经发现了约100种黏细菌次级代谢产物的基本结构和600种结构类似物［10］，为新结构或新作用机制生物活性物质的筛选提供了一类良好的微生物资源。黏细菌已经成为继放线菌、芽孢杆菌之后的第三大次级代谢产物产生菌。为了寻找新的抗肿瘤活性成分，2011年8月3日～11月20日，我们对黏细菌93431的次级代谢产物进行了分离纯化，从中分离到4种组分，利用MTT法对这4种组分的活性进行了检测。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 黏细菌93431菌株由河北省微生物多样性研究与应用重点实验室分离保存。

1.1.2 细胞 人乳腺癌细胞株MCF-7，人胚肺成纤维细胞株MRC，由武汉大学中国典型培养物保藏中心惠赠。

1.1.3 试剂及器材 种子培养基和发酵培养基的制作方法参见文献［11］;D312大孔吸附树脂(山东鲁抗医药集团有限公司);RPMI1640培养液(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);分析型高效液相色谱仪(日立L-2000，DAD 检测器，Thermo ODS-2，5 μm，250 mm ×4.6 mm);制备型高效液相色谱仪(美国SSI Prep Pump，Model 2001，GRACE Allsphere ODS-2，5 μm，250 mm×4.6 mm);自动离心浓缩仪(英国 miVac QUC-23050-100);显微镜(OLYMPUSBH-2 JAPAN);酶联免疫检测仪(德国BMG FLUOstar OPTIMA);冷冻干燥仪(SIM MCFD5508型)。

1.2 方法

1.2.1 黏细菌93431菌株发酵及其代谢产物的粗提 将93431菌种接种于CAS液体种子培养基，置于摇床中，28℃、200 r/min振荡培养4 d。再将种子液以10%接种量接种到VY/2液体发酵培养基(装液量300 mL)，摇床中28℃、100 r/min振荡培养7 d。将发酵液4 800 r/min离心10 min，除去上清液，收集得到菌体及树脂，向其加入15倍体积的甲醇，置于摇床上振荡，过夜浸提，浸提液用薄膜旋转蒸发仪浓缩，得到发酵产物的粗提物。

1.2.2 黏细菌93431菌株代谢产物的分离纯化

将得到的发酵产物用分析型高效液相色谱进行梯度洗脱(流动相组分及其比例见表1)，初步了解发酵产物的组成成分。针对发酵产物中含量较高的组分，设计洗脱方法，利用制备型高效液相色谱对其进行分离制备。将收集得到的不同组分置于自动离心浓缩仪中，37℃真空离心浓缩，除去甲醇。－80℃低温冰箱中过夜后，置冷冻干燥机中进行干燥，除去水分后得到干品。

表1 高效液相色谱梯度洗脱流动相组分及其比例

1.2.3 黏细菌93431菌株代谢产物活性测定及毒性检测 93431菌株代谢产物的活性测定采用MTT法［12］。取对数生长期的MCF-7，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配制成1×104/mL，每孔180 μL接种于96孔细胞培养板，置37℃、5%CO2培养箱中培养12 h。将分离得到的93431菌株代谢产物样品用完全培养基溶解，0.22μm无菌滤膜过滤除菌后再将样品稀释成4个浓度梯度，分别为100、50、25、12.5 μg/mL。样品组每孔加入 20 μL，每组设置4个复孔，以不加样品的孔作为空白对照。37℃培养24 h后，倒置显微镜下观察96孔板中各细胞形态的变化。然后每孔加入30μL的 MTT(5 mg/mL)液，继续培养4 h，弃上清液，加 DMSO 150 μL/孔，将96孔板震荡10 min后，492 nm波长测定光密度值(OD值)，按下列公式计算细胞抑制率:细胞抑制率=［1－(样品孔OD值/空白对照孔 OD值)］×100%。93431菌株代谢产物的毒性检测用MRC细胞模型，培养液改用含10%胎牛血清的DMEM，具体方法同上。

2 结果

2.1 93431菌株的性质及发酵培养结果 93431菌株为革兰阴性菌，呈细长杆状，在固体VY/2斜面上培养4～5 d即形成圆球形浅黄色子实体，无柄，较黏软。发酵液呈浅黄色且清澈透亮。

2.2 93431菌株次级代谢产物的分离纯化结果分离结果表明，93431菌株次级代谢产物成分比较复杂。对含量较高的组分即保留时间50～60 min的次级代谢产物进行分离。为了获得93431菌株发酵产物中的单一化合物，利用制备液相对其进行分离制备，流动相比例调整为甲醇∶水=72∶28，经过制备液相分离纯化，收集得到4种组分，即93431-1、93431-2、93431-3、93431-4，将这 4 种组分浓缩干燥后得到干品，均呈浅黄色粉末状，易溶于甲醇。

2.3 93431菌株次级代谢产物4种组分的活性测定及毒性检测结果 4种组分对MCF-7的抑制效果见表2。4种组分对MRC细胞的抑制效果见表3。由表2和表3可以看出，组分93431-2、93431-3和93431-4在100μg/mL浓度作用24 h时，对MRC细胞的抑制率分别为5.08%、12.47%和7.15%，显示出较低的细胞毒活性，但遗憾的是这3种组分对MCF-7细胞的抑制作用也并不明显，在同样条件下，对MCF-7细胞的抑制率分别为6.02%、19.55%和6.9%。而组分93431-1对MCF-7细胞显示出较强的抑制作用，在100μg/mL、作用24 h时，抑制率达到51.65%，而在同样条件下，对MRC细胞的抑制率仅为17.54%。

另外，在加入93431-1(100μg/mL)作用24 h后，MCF-7在形态上发生了很大变化，细胞萎缩呈小球状，细胞个数明显减少，个别细胞出现细胞核固缩，而空白对照组细胞形态饱满，有光泽，贴壁生长状态良好。MRC细胞在加入93431-1后，倒置显微镜下观察其形态与空白对照组相比并没有发生太大变化。

表2 93431菌株代谢产物各组分对MCF-7细胞的抑制率(¯x ±s)

表3 93431菌株代谢产物各组分对MRC细胞的抑制率(¯x ±s)

3 讨论

对于复发和转移的乳腺癌，通常用药物进行控制。但常用的化疗药物毒性很大，影响患者的生活质量。因此，研究和开发高效、低毒的抗乳腺癌药物格外重要。

本研究对河北省微生物多样性研究与应用实验室保藏的黏细菌93431菌株进行活化、培养和发酵，进行次级代谢产物的提取、收集，并利用分析型高效液相色谱对活性菌株的发酵液提取物进行了各组分的分离、纯化，利用MTT比色法筛选高效、低毒、有抗乳腺癌生物活性的物质。为活性组分的制备和结构测定以及为靶向抗乳腺癌药物的开发和利用做准备。

利用分析型高效液相色谱对93431菌株发酵液中次级代谢产物的分离纯化方法进行了系统的探索，确定了菌株93431代谢产物的洗脱条件，建立了适合菌株93431发酵液中活性产物的分析方法，即用 Thermo ODS-2、5 μm、250 mm ×4.6 mm 的色谱柱，选择甲醇和水为流动相，设定流速为1 mL/min，进行80 min梯度洗脱，从菌株93431的发酵代谢产物中发现了多个组分。

利用制备型高效液相色谱，即用GRACE Allsphere ODS-2、5 μm、250 mm ×10 mm 的色谱柱，选择甲醇∶水=72∶28为流动相，设定流速为4 mL/min，进行70 min等梯度洗脱，从菌株93431的发酵代谢产物中分析出4个组分，分别命名为93431-1、93431-2、93431-3、93431-4。

实验发现，组分93431-1对乳腺癌MCF-7细胞有明显的抑制作用，其浓度和其对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率之间存在较好的量效关系，随着93431-1浓度的增长，对乳腺癌MCF-7细胞的抑制率也增大。但因为实验所用样品的最大浓度为100μg/mL，未能测得93431-1对乳腺癌MCF-7细胞的最大抑制率。有待对组分93431-1、93431-2、93431-3和93431-4分别进行配伍，并进一步提高组分93431-1的浓度，对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用做更完善的研究。

组分93431-1呈浅黄色粉末状，有较强的极性，易溶于甲醇。采用MTT法以MCF-7、MRC细胞株作为实验模型进行93431菌株代谢产物的活性及毒性测定，结果表明组分93431-1对MCF-7细胞抑制效果明显，在药物浓度为100μg/mL作用24 h的条件下，93431-1对MCF-7细胞的抑制率达到51.65%，且对MRC细胞毒性较小。对93431-1的结构测定及其抗癌活性的机理的研究正在进行之中。

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