非小细胞肺癌组织中Cyclin D1、p16蛋白的表达变化及意义

张永明，李 辉，杨文锋，刘 杰，张百江

(山东省肿瘤医院，济南250117)

细胞周期蛋白Cyclin D1是原癌基因，其编码的蛋白产物在细胞周期G1→S检查点中发挥正性调控作用，启动细胞周期并促进DNA合成，加速细胞增殖。p16基因作为肿瘤抑制基因，在许多人类原发性肿瘤和细胞株中的突变率为30% ～80%，该基因编码的蛋白能特异性抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4)的活性，有效阻止细胞进入S期。本研究采用免疫组化法对非小细胞肺癌 (NSCLC)组织中的Cyclin D1、p16蛋白进行了检测，观察其表达变化并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2004年1月～2005年5月在山东省肿瘤医院接受手术治疗的NSCLC患者96例(均经病理检查确诊);男52例，女44例;年龄30～76岁。术前无放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗史。不吸烟和吸烟指数≤400年支者36例，吸烟指数＞400年支者60例。本组肿瘤直径≤3 cm者27例、＞3 cm者69例;鳞癌28例，腺癌39例，细支气管—肺泡癌13例，腺鳞癌11例，大细胞癌5例。按2009年NCCN制定的NSCLC分期标准分为Ⅰ期23例、Ⅱ期48例、Ⅲ期25例;组织学分级为Ⅰ级27例、Ⅱ级43例、Ⅲ级26例。发生淋巴结转移57例，无淋巴结转移39例。取15例良性肺部疾病患者的肺部正常组织作对照，其中肺炎性假瘤8例、肺硬化性血管瘤3例、肺结核4例。

1.2 Cyclin D1、p16蛋白检测方法 两组标本用10%甲醛固定，常规脱水透明，石蜡包埋，4μm厚连续切片。采用免疫组化SP法染色［兔抗人单克隆抗体Cyclin D1(即用型)、兔抗人单克隆抗体p16(即用型)、DAB显色剂及SP试剂盒购自福州迈新公司］。用试剂盒提供的阳性切片(乳腺癌)作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。以细胞核或细胞质出现棕黄色为Cyclin D1、p16蛋白表达阳性。参考Mattern等［1］介绍的方法，采用阳性细胞半定量分级法对染色结果进行评定:未见细胞染色为0分、细胞轻度染色为1分、细胞中度染色为2分、细胞深度染色为3分;无阳性细胞为0分，阳性细胞＜25%为1分、26% ～50%为2分、≥51%为3分;上述两分值相加，最高分为6分。高倍镜(×400)下观察10个视野并进行计分，取平均分值，得分0、1分为－，2分为+，3、4分为 ++，5、6分为 +++;+～+++判为阳性，－判为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计数资料比较用χ2检验，等级资料进行Spearman等级相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在NSCLC组织、肺部正常组织中，Cyclin D1蛋白呈阳性表达者分别为60、1例，p16蛋白呈阳性表达者分别为63、14例，两种组织中两个指标的表达相比，P均＜0.05。Cyclin D1蛋白的表达与NSCLC组织学分级及淋巴结转移有关(P均＜0.05)，与其余病理参数无关(P均＞0.05);p16蛋白的表达与NSCLC临床病理参数无关(P均＞0.05)，详见表1。NSCLC组织中Cyclin D1、p16蛋白的表达呈负相关(rs= －0.298，P ＜0.01)，详见表 2。

表1 Cyclin D1、p16蛋白表达与NSCLC临床病理参数的关系(例)

表2 NSCLC组织中Cyclin D1、p16蛋白表达的关系(例)

3 讨论

Cyclin D1蛋白与CDK4或CDK6在细胞G1期结合形成复合物，并作为视网膜母细胞瘤(Rb)编码蛋白pRb的激酶，使其磷酸化后释放出与其结合的转录因子E2F，驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖。Cyclin D1蛋白过表达是导致G1→S检测点缺陷的主要原因。当Cyclin D1蛋白表达失控时，会导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖，从而导致肿瘤的发生［2］。

研究［3］认为，Cyclin D1蛋白的过表达是NSCLC发生的一个早期分子事件。本研究检测的NSCLC组织及肺部正常组织中Cyclin D1蛋白的表达与文献［4～6］报道近似。Jin 等［7］研究发现，Cyclin D1 蛋白在肺鳞癌组织中的表达高于腺癌，但本研究无类似发现。Volm等［8］发现，在肺鳞癌组织中 Cyclin D1蛋白的表达与吸烟有关，而在肺腺癌组织中Cyclin D1蛋白的表达与患者吸烟无关。本研究结果显示，Cyclin D1的表达与患者吸烟指数无关，与NSCLC组织学分级有关，与Betticher等［3］的研究结果一致。有研究［9］发现，NSCLC的转移与Cyclin D1蛋白的阳性表达呈正相关，而且还与Cyclin D1蛋白表达的位置密切相关，即Cyclin D1蛋白对细胞周期的调控不单纯限于时间上，还表现为空间调控。Jin等［7］发现，Cyclin D1蛋白表达在细胞质和细胞核内，一部分表达在核膜下，推测Cyclin D1蛋白在细胞质的表达可能是蛋白产生过多，也可能是核转运信号的突变所致。本研究发现，部分NSCLC组织中癌细胞的细胞核呈棕黄色，于核边缘近核膜处浓聚，在肺部良性病变组织中Cyclin D1蛋白位于胞质，具体机制不明。本研究发现，Cyclin D1蛋白表达与NSCLC 的淋巴结转移有关，与文献报道一致［5，10］。表明Cyclin D1蛋白在NSCLC中的过度表达，使肿瘤细胞增殖能力增强，有利于肿瘤的生长、浸润和转移。关于Cyclin D1蛋白过度表达与NSCLC分期及预后的关系，文献报道一直存在分歧。本研究未发现Cyclin D1蛋白的表达与NSCLC临床分期有关。

p16蛋白是多肿瘤抑制基因(MTSI)，通过抑制CDK4的活性而发回调节作用，而p16蛋白表达的生物学效应受Cyclin D1的影响，它可与Cyclin D1蛋白竞争调控CDK4/CDK6的活性，从而阻止、控制细胞分裂，诱导细胞分化，p16通过负性调节AUF1而控制Cyclin D1蛋白和 E2F1的表达［11］。p16基因突变和缺失引起p16蛋白非正常表达时，使细胞增殖失控，导致肿瘤细胞无限制性生长［12］。大多数恶性肿瘤存在p16蛋白表达下调。表明p16基因在肿瘤发生、发展过程中扮演重要角色［13］。本研究发现，p16蛋白在NSCLC组织中的表达减弱，其表达与患者年龄、性别、吸烟指数及NSCLC组织学分类、分级、临床分期无关，这一结果与文献报道近似［7，14］。Shapiro 等［15］发现，p16 基因突变与 p16 蛋白不表达率存在不一致性，p16基因的缺失出现率较p16蛋白表达缺失的出现率明显降低，认为肺癌组织中p16蛋白表达缺失与p16基因的缺失关系不大，而与p16基因表达的调控关系密切，并认为p16蛋白的检测比p16基因本身的检测意义更大。本研究发现，NSCLC组织中p16、Cyclin D1蛋白的表达呈负相关，表明只有Cyclin D1和p16蛋白保持正负调节平衡，才能协调细胞的正常分化和增殖，它们的表达失衡将导致细胞周期失控而导致肿瘤的发生。

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