青蒿琥酯对人结肠癌HCT-8细胞诱导血管新生的影响及机制探讨

黄伟炜，杨 莹，刘 宁

(1海南省人民医院，海口570311;2黑龙江护理高等专科学校)

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有良好的水溶性和抗疟效果，同时表现出强大的抗肿瘤活性［1］。研究［1，2］发现，青蒿琥酯具有很强的抗结肠癌作用，但对于其抗癌机制尚不清楚。我们的前期研究结果表明，较低浓度(＜15μmol/L)的青蒿琥酯即可抑制体外培养的人结肠癌HCT-8细胞增殖、迁移［3］。2010年6月1日～2011年6月30日，我们观察了青蒿琥酯对人结肠癌HCT-8细胞诱导血管新生的影响，并观察了经青蒿琥酯作用的HCT-8细胞的血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-2(Ang-2)的表达变化。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 青蒿琥酯购于桂林南药股份有限公司(批号H10930195)，用于实验时先用0.5%的NaHCO3溶解，再用生理盐水配置成所需浓度。VEGF鼠单抗和Ang-2兔多抗购于Santa Cruz公司。EliViaionTMplus鼠/兔通用试剂盒和DAB显色试剂盒购于迈新生物公司。

1.2 细胞培养 人结肠癌HCT-8细胞(由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供)置含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞处于对数生长期时分组，青蒿琥酯组分别加入不同浓度青蒿琥酯，阳性对照组不加任何药物;同时设阴性对照组(为单纯RPMI1640培养基)。

1.3 大鼠主动脉环体外生长实验 将青蒿琥酯组、阳性对照组细胞用RPMI1640冲洗3次，放入无血清RPMI1640培养液中孵育4 h;离心收集细胞后用无血清RPMI1640液稀释至1×106/mL，继续培养24 h。无菌条件下1 200 r/min和12 000 r/min分别离心10 min，获得条件培养液。取1 mm长大鼠新鲜胸主动脉环30个，置入由纤维蛋白原、牛凝血酶、无血清培养液MCDB-131等混合制成的凝胶中，于37℃、5%CO2培养箱中孵育3 d。分别加入各组条件培养液，与大鼠主动脉环一起孵育。每日观察新生血管生长情况，第14天血管生成达高峰，每组各取6个主动脉环，计数新生血管数。实验重复3次，取均值。

1.4 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长实验鸡胚孵化4 d，在近气室处开口，暴露接种部位，置孵箱内稳定24 h后分组并作相应处理。①阴性对照组:将浸有RPMI1640、约1 mm×1 mm×1 mm大小的可吸收明胶海绵(无菌)置于鸡胚接种部位。②阳性对照组:按照该实验标准流程，在第6天将浸有100μL HCT-8细胞悬液的可吸收明胶海绵(无菌)置于鸡胚接种部位。③青蒿琥酯组:将部分阴性对照组鸡胚额外孵育1 d，分别给予100μL不同浓度青蒿琥酯处理后的HCT-8细胞悬液于可吸收明胶海绵上。上述三组鸡胚用消毒的半透明封口膜封口，置孵箱中孵育，至第12天小心剥离各鸡胚绒毛尿囊膜，固定后于400倍光镜下观察并拍照，管腔小于8个红细胞大小且不带肌层的小管腔血管为微血管，观察5个高倍视野，取均值作为每例标本的微血管密度。实验重复3次，取均值。

1.5 VEGF、Ang-2蛋白的检测 采用 Western blot法。分别收集“1.2”的各组细胞，提取细胞总蛋白，定量后加入等体积2×上样缓冲液，煮沸。取部分蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭，加入相应一抗，4℃过夜(β-actin为内参照)，洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，DAB显色，IPP光密度分析软件进行蛋白条带的光密度检测。用目的蛋白条带与内参蛋白条带的光密度比值表示目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。实验数据均以¯x±s表示，样本均数的比较用Dunnett＇s t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青蒿琥酯对HCT-8细胞诱导的血管生成的影响 大鼠主动脉环体外生长实验结果显示，阳性对照组于第3天起镜下可见有新生血管生成，第7～13天新生血管迅速增多，第14天后血管生成速度减慢、生成量逐渐减少;青蒿琥酯组新生血管形成时间明显滞后，于第7～10天才见有新生血管出现，同时血管萌芽密度明显降低，呈青蒿琥酯剂量依赖性。至第14天，阳性对照组新生血管数为(127.5±7.86)条，阴性对照组为(61.17 ±6.13)条，两组相比P ＜0.01;3、6、12 μmol/L 青蒿琥酯组新生血管数分别为(55.23 ±3.68)、(32.84 ±4.13)、(12.66 ±2.71)条，与阳性对照组相比，P 均＜0.05;与阴性对照组相比，P＞0.05(3μmol/L青蒿琥酯组)和P＜0.05(6、12 μmol/L 青蒿琥酯组)

鸡胚绒毛尿囊膜体内血管生长实验结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组可见有大量新生微血管呈放射状排列于海绵周围，血管密度增大、分支明显增多、管径增粗。阳性对照组新生血管数为(63.00±4.62)条，阴性对照组为(39.00 ±3.25)条，两组相比，P＜0.01。青蒿琥酯组的血管密度、分支减少，管径变细，3、6、12μmol/L青蒿琥酯处理组血管数分别(47.00 ±3.65)、(38.00 ±2.41)、(17.00 ±2.67)条，与阳性对照组相比(血管数分别减少22.9%、36.24%、74.82%)，P 均 ＜ 0.01;与阴性对照组相比，P＞0.05(3、6μmol/L青蒿琥酯组)和P＜0.05(12μmol/L青蒿琥酯组，血管数减少56.4%)。

2.2 青蒿琥酯对HCT-8细胞VEGF、Ang-2表达的影响 各组HCT-8细胞VEGF、Ang-2表达比较见表1。

表1 各组HCT-8细胞VEGF、Ang-2表达比较(¯x±s)

3 讨论

目前，手术切除仍是治疗结肠癌的首选方法，但由于术后局部复发和转移率较高，患者5年生存率仍较低。肿瘤浸润和转移依赖肿瘤新生血管的形成。研究［4］证实，结肠癌组织中存在明显的血管新生现象。结肠癌组织微血管密度与结肠癌的临床分期有关，是结肠癌独立的预后因素［4，5］。本观察结果显示，阳性对照组HCT-8新生血管明显多于阴性对照组和青蒿琥酯组，同时还高表达血管新生调控因子VEGF和Ang-2，进一步提示结肠癌细胞具有极强的血管新生促进能力。

体外实验结果显示，青蒿琥酯可抑制体外培养的骨髓瘤、白血病、卵巢癌细胞等诱导的血管新生［6～8］;体内实验亦发现青蒿琥酯可抑制 Kaposi肉瘤鼠模型中肿瘤组织血管的生长［9］。在本研究中，大鼠主动脉环体外生长实验结果显示，与阳性对照组相比，青蒿琥酯组主动脉环上血管萌芽出现时间明显延迟，密度低，且呈青蒿琥酯浓度依赖性。鸡胚尿囊膜体内血管生长实验结果显示，与阳性对照组相比，青蒿琥酯组尿囊膜血管分支显著减少，密度下降。上述体内、体外实验结果均提示青蒿琥酯具有抗结肠癌HCT-8细胞诱导血管新生的能力。

血管新生受多种因素的调控，其中专一作用于血管内皮细胞的VEGF和Ang-2相互协调，在血管形成过程中起关键作用［10］。VEGF是经典血管生成促进因子，主要促进血管内皮增殖。Ang-2是近年发现的另一种对血管内皮有专一性的促血管新生因子家族成员，其主要作用是促进内皮细胞渗漏，诱使其出芽，与VEGF相互协调，促进血管新生。已经证实 VEGF 和 Ang-2 在结肠癌中呈高表达［4，11，12］。本研究结果显示，较低浓度的青蒿琥酯(3μmol/L)即可抑制HCT-8细胞VEGF和Ang-2的表达。提示青蒿琥酯对HCT-8细胞诱导血管新生的抑制效应可能与其下调该细胞VEGF和Ang-2的表达有关，但其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，青蒿琥酯不但可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移，还对其诱导血管新生的能力有抑制作用。青蒿琥酯对结肠癌细胞诱导血管新生的抑制效应可能与其下调结肠癌细胞VEGF和Ang-2的表达有关。

［1］He RR，Zhou HJ.Progress in research on the anti-tumor effect of artesunate［J］.Chin JIntegr Med，2008，14(4):312-316.

［2］Efferth T，Dunstan H，Sauerbrey A，et al.The anti-malarial artesunate is also active against cancer［J］.Int J Oncol，2001，18(4):767-773.

［3］黄伟炜，牛红军，刘宁.青蒿琥酯对人结肠癌HCT-8细胞侵袭能力影响及机制研究［J］.中成药，2011，33(12):34-36.

［4］钟世顺，张振书，李淑梅，等.结肠癌血管内皮生长因子与微血管密度和p53的关系［J］.中华消化杂志，2001，21(6):339-342.

［5］周卫真，陈文明，王世鑫，等.大肠癌患者血管新生及嵌合体血管的临床研究［J］.中华实用内科杂志，2005，25(6):522-524.

［6］Chen H，Shi L，Yang X，et al.Artesunate inhibiting angiogenesis induced by human myeloma RPMI8226 cells［J］.Int J Hematol，2010，92(4):587-597.

［7］Zhou HJ，Wang WQ，Wu GD，et al.Artesunate inhibits angiogenesis and downregulates vascular endothelial growth factor expression in chronic myeloid leukemia K562 cells［J］.Vascul Pharmacol，2007，47(8):131-138.

［8］杨素梅，刘可玲，王立敏，等.青蒿琥酯对人卵巢癌细胞诱导血管新生的抑制效应［J］.河北医药，2011，33(13):1949-1951.

［9］Dell'Eva R，Pfeffer U，Vene R，et al.Inhibition of angiogenesis in vivo and growth of Kaposi＇s sarcoma xenograft tumors by the antimalarial artesunate［J］.Biochem Pharmacol，2004，68(9):2359-2366.

［10］Karamysheva AF.Mechanisms of angiogenesis［J］.Biochemistry，2008，73(7):751-762.

［11］Ahmad SA，Liu W，Jung YD，et al.The effects of angiopoietin-1 and-2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer［J］.Cancer Res，2001，61(4):1255-1259.

［12］李林海，高青，王永占，等.结肠癌组织HIF-1α和VEGF-C的表达及临床意义［J］.肿瘤防治研究，2009，36(8):676-678.