阿托伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤后硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和多配体蛋白聚糖的干预作用

曹明晶 周 平 李法琦 (重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 400016)

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是细胞膜及细胞外基质中的一种蛋白聚糖，具有多种重要的生物学功能，如维持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，维持血管通透性，抑制细胞黏附〔1～3〕，调节细胞的增殖等。多配体蛋白聚糖(SDC－1)属于黏附分子整合素跨膜黏结蛋白聚糖家族成员，在炎症过程中通过其胞外段硫酸乙酰肝素链(属于GAGs)共价结合多种胞外配体，结合各种生物分子及调节各种结合蛋白的生物学功能，参与炎症反应的多个环节〔4〕。但有关HSPG和SDC－1在心肌缺血再灌注的表达水平及阿托伐他汀对两者的影响鲜见报道。本实验以大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)为模型，分析阿托伐他汀对大鼠MIRI后HSPG和SDC－1的干预作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠，体质量(250±30)g，合格证号:SCXK(渝)2007－0001，由重庆医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品及试剂 阿托伐他汀(大连辉瑞制药有限公司)，HSPG、syndecan－1单克隆抗体(Santa Cruz)，免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，RT－PCR 试剂盒(TaKaRa)，HSPG、SDC－1 ELISA 试剂盒(R＆D)。

1.3 实验分组与给药 健康SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只，建造MIRI模型。假手术组:只穿线不结扎冠状动脉;IR组:穿线结扎冠状动脉30 min，再灌注120 min;阿托伐他汀组:穿线结扎冠状动脉30 min，再灌注120 min，手术前3 d给予阿托伐他汀(20 mg·kg－1·d－1)灌胃;生理盐水组:穿线结扎冠状动脉30 min，再灌注120 min，手术前3 d给予生理盐水1 ml灌胃。实验结束后各组随机抽取4只制作病理切片，其余各组6只观察其他指标。

1.4 实验方法与观察指标

1.4.1 实验动物MIRI模型的制作 大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，气管插管，接动物人工呼吸机(80次/min，潮气量20 ml/kg，呼吸比1∶1)，链接多功能生理记录仪记录心电图。在胸骨左缘3、4肋间开胸，打开心包膜，暴露心脏。于冠状动脉左前降支起始0.2 cm处与肺动脉圆锥旁之间垫一2 mm聚乙烯小管加压，用6－0缝线结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min。结扎成功即心电图导联ST段抬高，局部心肌明显变苍白，再灌注成功即苍白心肌恢复红润或出现再灌注心律失常。

1.4.2 心肌形态学结构的观察 实验结束立即取下心脏，用生理盐水洗净心腔内积血后迅速放入4%多聚甲醛中固定。从心尖以间距0.3 cm横向连续切片至冠脉穿线处，石蜡包埋切片，HE染色，于光学显微镜下观察心肌形态变化。

1.4.3 免疫组化检测冠状动脉左前降支HSPG、SDC－1表达每只大鼠石蜡切片5张，常规脱蜡水化，抗原修复，抗HSPG(1∶100)、SDC－1(1∶50)抗体孵育，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4.4 RT－PCR检测HSPG、SDC－1 mRNA表达 每组大鼠随机取6只快速留取冠状动脉左前降支，加液氮研磨，按试剂盒说明用Trizol提取的步骤进行总RNA提取，得到的总RNA测定OD值，取OD值在1.8～2.0之间的总RNA进行逆转录，逆转录步骤按试剂盒说明进行。每一标本取 cDNA 1 μl进行PCR反应，PCR反应体系为25 μl。所用引物由上海Invitrogen生物技术公司合成:HSPG正义链:5′－GAT CTGACAACATCCCAACTGA－3′，反义链:3′－AACAACAGGATGAGGAAAATGG－5′(302 bp);SDC－1 正义链:5′－CAGCAGCAACACCGAGAC－3′，反义链:3′－CTCCTACCTTGACGGTTAG－5′(359 bp);GAPDH 正义链:5′－AGGCCGGTGCTGAGTATGTC －3′，反 义 链:3′－T GCCTGCTTC ACCACCTTCT－5′(530 bp)。PCR 反应条件:94℃预变性3 min，94℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃ 延伸 45 s，共 35 个循环，72℃最后延伸5 min。取PCR产物3 μl，2%琼脂糖上电泳，凝胶成像分析系统进行条带光密度半定量分析，计算HSPG、SDC－1 mRNA 相对值。

1.4.5 ELISA检测血清中HSPG、SDC－1含量 实验结束后经颈静脉取血，2000 r/min，离心5 min，取上层血清－20℃保存。根据试剂盒说明，ELISA法测定血清HSPG、SDC－1含量。

1.5 统计学分析 应用SPSS17.0统计分析软件处理数据。计量数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 心肌组织形态学的变化 光镜下假手术组心肌纤维排列整齐，染色均匀，横纹清晰，心肌间质无炎性细胞浸润，无出血坏死;IR组心肌纤维肿胀，排列紊乱，有灶性出血，心肌间质大量炎性细胞浸润;阿托伐他汀组心肌纤维轻度肿胀，心肌间质无出血，有少量不等的炎性细胞浸润;生理盐水组心肌组织形态与IR组相似。见图1。

2.2 免疫组化检测冠状动脉左前降支HSPG、SDC－1表达 在假手术组冠状动脉左前降支内膜内皮细胞的基底膜处有较多HSPG和SDC－1阳性物质的表达，但IR组HSPG和SDC－1的表达明显减少或缺如，说明MIRI可导致内皮细胞糖萼受损。与IR组和生理盐水组相比，阿托伐他汀组HSPG和SDC－1表达增多，提示阿托伐他汀可抑制内皮细胞糖萼脱落。见图2。

图1 心肌组织HE染色(×100)

2.3 RT－PCR测定冠状动脉左前降支 HSPG、SDC－1 mRNA表达 灰度扫描结果显示，与假手术比，IR组大鼠冠状动脉左前降支HSPG、SDC－1含量减少(P＜0.05)，但与生理盐水组无明显差异(P＞0.05);与IR组和生理盐水组比，阿托伐他汀组大鼠冠状动脉左前降支HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)。见图3、表 1。

2.3 ELISA检测血清中HSPG、SDC－1含量变化 结果显示，与假手术比，IR组大鼠血清中HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)，但与生理盐水组无明显差异(P＞0.05);与IR组和生理盐水组比，阿托伐他汀组大鼠血清中 HSPG、SDC－1含量减少(P＜0.05)。见表1。

表1 各组冠状动脉左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表达及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

表1 各组冠状动脉左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表达及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

与假手术组比较:1)P＜0.05;与IR组比较:2)P＜0.05

组别 mRNA 血清1.07±0.04 0.98±0.05 233.83±0.99 34.17±0.73 IR组 0.37±0.021) 0.42±0.031) 827.53±0.981)119.44±0.941)阿托伐他汀组 0.71±0.401) 0.76±0.021)560.53±0.581)2)61.65±0.741)2)生理盐水组 0.40±0.011)2)0.43±0.031)2)827.35±0.721)118.94±0.561)HSPG SDC－1假手术组HSPG SDC－1

图2 各组冠状动脉左前降支HSPG、SDC-1表达(×100)

图3 冠状动脉左前降支HSPG、SDC-1 mRNA表达

3 讨论

HSPG是细胞膜及细胞外基质中的一种蛋白聚糖，具有多种重要的生物学功能，如维持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，维持血管通透性，抑制细胞黏附〔1～3〕，参与某些生长因子与其受体的结合，调节细胞的增殖等。由于其多样化的结构功能和在细胞识别、细胞黏附中的作用日益受到重视，成为当今研究的热点之一。SDC－1属于黏附分子整合素跨膜粘连蛋白聚糖家族成员，通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结合一系列配基，如细胞黏附分子、基质成分、生长因子、酶和酶抑制物等，以共受体方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与新生血管形成、伤口愈合以及白细胞与内皮细胞间的相互作用〔5〕。近年来，其在血管内皮细胞中的作用逐渐得到国内外学者重视。

HMG－CoA还原酶抑制剂，能通过抑制HMG－CoA还原酶而抑制胆固醇的合成，是目前临床上治疗高胆固醇血症最有效的一类药物。但他汀类药物除治疗高脂血症外，还具有以下重要作用〔6～8〕:①抗炎作用:大量的动物实验已表明这类药物能减少肿瘤坏死因子α、白细胞介素－1和白细胞介素－6。②改善血管内皮细胞功能:他汀类药物通过激活磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶Akt通路，增加血管内皮细胞NO合酶活性和NO的生成，从而改善内皮细胞功能。本实验结果说明在心肌缺血再灌注损伤中，阿托伐他汀可明显减少炎性细胞的浸润，减少心肌纤维断裂坏死，维持细胞正常形态结构，可见阿托伐他汀具有明显心脏保护作用。

研究表明，心肌缺血在灌注本身是一种过度的炎症反应结果，在缺血坏死心肌灶上可见有明显的炎症细胞浸润，而趋化因子及白细胞是心肌局部缺血的联集反应的起始原因之一〔9～11〕。即使缺血的心肌复流减少了心肌坏死，但再灌注的血液成分中含趋化因子募集来的炎症介质可损伤心肌，从而引起再灌注损伤。HSPG和SDC－1可通过抑制凝血及细胞黏附等生物功能发挥一系列血管保护作用。本实验说明缺血再灌注损伤可使内皮细胞上HSPG、SDC－1发生脱落，从而减弱其对血管的保护作用，本实验阿托伐他汀可以抑制内皮细胞上HSPG、SDC－1脱落而发挥其心血管保护作用。但生物体是复杂的整体，其生物学反应是复杂且相互关联的，外源因素与基因表达的作用也是非常复杂的，所以阿托伐他汀抑制内皮细胞HSPGS、DC－1脱落的机制有待进一步研究。

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