竞争性ELISA法测定软骨细胞蛋白聚糖代谢片段的可行性分析

周惠琼 张 清 叶 彬 孙晓萱 杨文芳



竞争性ELISA法测定软骨细胞蛋白聚糖代谢片段的可行性分析

周惠琼 张 清 叶 彬 孙晓萱 杨文芳

目的 本研究探讨竞争性ELISA法测定软骨细胞蛋白聚糖代谢片段的可行性，为蛋白聚糖相关研究提供一个新的方法。方法 利用单克隆抗体(Mab-5D4)通过竞争性ELISA 法检测体外培养的兔关节软骨细胞蛋白聚糖的代谢片段，摸索最佳实验条件，计算本方法的板间差异和板内差异，同时通过DMMB分光光度法测定蛋白聚糖的代谢物糖胺聚糖(GAG)，并比较它们的相关性。结果 竞争性ELISA法测定蛋白聚糖5D4片段方法的板间差异为10.38%，板内差异为3.91%，实验组培养上清液5D4片段的浓度明显高于对照组(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。与常规分光光度法测定蛋白聚糖的代谢物GAG有较好的相关性(r=0.453～0.579，P=0.001)。结论 竞争性ELISA法测定蛋白聚糖代谢产物方法简便，重复性好，可应用于蛋白聚糖代谢的相关研究。

蛋白聚糖 ELISA 软骨细胞

软骨是关节的主要结构之一，蛋白聚糖(aggrecan)与Ⅱ型胶原同为关节软骨的主要成分，其中蛋白聚糖异常代谢是软骨病变的主要表现，常见的关节炎如骨关节炎(osteoarthritis,OA)及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)都存在蛋白聚糖的异常代谢。既往蛋白聚糖的代谢研究常采用DMMB分光光度法测定蛋白聚糖的代谢物糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)来代表蛋白聚糖的降解，影响因素多，结果不稳定。近年来发现用针对蛋白聚糖代谢片段的单克隆抗体(Mab)通过ELISA法来检测蛋白聚糖的不同代谢片段，方法简单，重复性好，有一定的应用价值[1,2]。其中Mab-5D4 为一种识别蛋白聚糖代谢片段的单克隆抗体，它可与蛋白聚糖核心蛋白区的硫酸角质素(keratinsulphate，KS)链中重复出现的硫化七糖结合，所检测产物5D4片段是蛋白聚糖降解的标志物[3]。本实验利用Mab-5D4通过竞争性ELISA 法检测体外培养的软骨细胞蛋白聚糖的代谢片段，以其摸索出一种简便而又实用的检测蛋白聚糖代谢片段的方法，应用于蛋白聚糖相关的科研和临床研究。

材料与方法

1.主要试剂：牛软骨提取的蛋白聚糖(Sigma公司),Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)，二甲基亚甲蓝(1,9-dimethylmethylene blue，DMMB，Serva公司)，硫酸软骨素A(Seikagaku Kogyo公司)，细胞培养液达氏修正依氏培养基(DMEM)/F12(Invitrogen公司)，软骨细胞源自新西兰大白兔(西澳大学动物中心提供)，Mab-5D4(Mdbioproducts公司)。本研究通过中日友好医院伦理委员会批准。

2.软骨细胞培养：软骨细胞取自新西兰大白兔膝关节的股骨髁。软骨细胞原代培养方法参照文献[4]。细胞单层融合后按1∶2传代，第1代软骨细胞采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率，选择细胞存活率均>95%的适当实验浓度做进一步的实验。将第1代软骨细胞转入12孔的组织细胞培养板，每孔细胞数为1.5×105/L，培养48 h后，为去除小牛血清对GAG和蛋白聚糖分解片段测定的干扰，用不含小牛血清的培养液洗涤2次。此后的培养均采用无小牛血清的培养液。将软骨细胞随机分为对照组、TNF-α组，每组设3孔，TNF-α组为培养液中含10 ng/ml的TNF-α,对照组为培养液中无任何刺激因子。所有细胞继续培养8天，每2天更换收集培养液并储存于-20℃冰箱待进一步实验用。

3.竞争性ELISA法检测蛋白聚糖的代谢片段[5]：为了去除边沿效应，每次实验只利用标准酶标板居中的60孔，舍弃周边孔。标准参照物为软骨素酶处理后的蛋白多糖(protroglycan treatment with chondroitinase,PG CASE)。(1)确定Mab-5D4在ELISA中的最佳作用浓度: 将购置的原液Mab-5D4按1/500、1/5000、1/10000、1/20000、1/40000及1/80000稀释，以吸光度约为1，斜率最大处的Mab-5D4稀释度为最佳工作浓度。(2)建立标准曲线：每一酶标板均建立标准曲线，标准曲线的稀释浓度为：PG CASE: 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9ng/ml。复孔检测，并设空白对照及非特异结合孔。(3)检测本实验中ELISA方法的稳定性：通过测定本实验方法的酶标板板间差异(inter-run variability)和板内差异(intra-run variability)，用以下的公式计算板间和板内的变异系数(coefficient of variance, CV)，了解本实验方法的稳定性。CV=标准差/均数(A值)×100%。板内的变异系数：同一份待测的培养液，在同一酶标板同时测定6次，复孔测定，共12孔。取A值计算CV。板间的变异系数：同一份待测培养液在不同的酶标板中重复测定6次，复孔检测，取A值计算CV。

4.测定细胞培养液中蛋白聚糖5D4代谢片段: 用125ng/ml的PG CASE包被酶联反应板,100微升/孔, 4℃湿盒过夜。弃包被液,200μl封闭液37℃封闭1h,洗涤液洗涤3次。用稀释液配制10个1∶2连续稀释的标准抗原(PG CASE)溶液；取150μl的Mab-5D4(1∶200000稀释),加到圆底的微量滴定板的每个孔中,再加入150μl不同稀释倍数的标准抗原。 同时以相同方法混合Mab-5D4和待测培养液(均适当比例稀释),混匀溶液,37℃放置60min。将100μl的标准混合液及待测混合液转移到抗原包被板中,37℃作用1h，洗涤3次。加入酶标Ⅱ抗(羊抗鼠IgG)到各反应孔中,100微升/孔,37℃作用60min，洗涤3次。将底物加入到各反应孔中,100微升/孔, 37℃作用90min。加入50微升/孔的终止液。

5.软骨细胞及培养液中GAG的测定：GAG的含量采用DMMB分光光度法测定，体外软骨细胞培养过程中，GAG释放入培养液中的水平代表蛋白聚糖的降解程度，释放入培养液中的GAG越多．表明蛋白聚糖的降解越明显。本实验采用GAG释放至培养液中的量占总体GAG(细胞内+培养液)的百分率表示蛋白聚糖的降解。

结 果

根据不同Mab-5D4抗体浓度的实验结果，1/200000Mab-5D4稀释度为本研究ELISA法最佳工作浓度。应用竞争性ELISA法检测蛋白聚糖代谢片段5D4的结果稳定性，板内差异见表1，板间差异CV的结果见表2。

表1 同一份待测培养液在同一酶标板重复测定6次(共12孔)的A值

表2 同一份待测培养液在不同酶标板重复测定6次(共12孔)的A值

图1 ELISA法测定培养液中5D4片段含量的标准曲线

ELISA法测定培养液中5D4片段含量的标准曲线(以其中一酶标板为例，图1)。培养8天时培养液中5D4片段总含量测定，试验组培养液中5D4片段的含量与对照组比较明显增多(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。培养不同时间(2～8天)时，培养液中两组细胞5D4片段释放均逐渐减少，培养的前3个时间段(2、4和6天)， TNF-α组释放的5D4片段均比对照组明显增多(P=0.000)。而培养的最后两天，两组细胞释放的5D4片段无区别。

表3 软骨细胞培养不同时间段培养液中5D4含量及GAG释放的百分率

#组别1、2、3、4分别代表培养的时间段：2、4、6及8天。与对照组比较，*P=0.000

软骨细胞培养不同时间段(2～8天)时GAG释放入培养液的百分率在培养的第1时段(2天)，TNF-α组软骨细胞GAG释放高于对照组(61.47%±12.90% vs 34.54%±6.43%,P=0.000),其余3个时间段两组无差别,详见表3。软骨细胞培养的不同时间段GAG的释放与5D4片段检测的结果呈明显正相关(r=0.453～0.579，P=0.000)。

讨 论

软骨是关节的重要组成部分，软骨细胞的主要功能是分泌细胞外基质，维持软骨的正常代谢从而维持关节的完整性和稳定性。蛋白聚糖是软骨细胞的产物之一，与Ⅱ型胶原同为关节软骨的主要构成成分。20世纪60年代，国外研究者就对蛋白聚糖异常代谢与关节疾病间的关系做了相关研究，认为蛋白聚糖的进行性破坏与关节病变有明显的相关性，OA患者血清及关节液的蛋白聚糖代谢片段水平与关节的放射学改变有关，蛋白聚糖的异常代谢可望能预测关节破坏的进程[6～8]。

蛋白聚糖的主体结构由一个核心蛋白和3个球状结构域(globular domain, G1, G2, G3)组成。核心蛋白在G2和G3之间，是富含GAG侧链的区域，GAG的主要成分是硫酸角质素(KS)和硫酸软骨素(chondroitin, CS)，核心蛋白的GAG区域是易受蛋白酶作用的部位，测定GAG的分泌常作为蛋白聚糖代谢的指标。近年来，针对蛋白聚糖不同部位的Mab逐渐用于研究与关节相关的蛋白聚糖代谢[9,10]。Straglics等[11]用多种针对蛋白聚糖不同部位的Mab检测幼年特发性关节炎患者的关节液，发现他们的蛋白聚糖代谢模式不同于成年OA患者。

Mab-5D4 为一种识别蛋白聚糖代谢片段的单克隆抗体，它可与蛋白聚糖核心蛋白区的KS链中重复出现的硫化七糖结合，所检测产物5D4片段是蛋白聚糖降解的标志物[3]。既往研究发现体外培养的猪软骨小体在机械性压力作用下，5D4片段不同程度地增多，其增多的程度和蛋白聚糖代谢的标志物GAG的变化相平行。在十字韧带切断的损伤性膝关节炎模型中，损伤后的第1周90%的关节积液中5D4片段明显增多，在2～3周所有损伤关节的积液均可检测到5D4 片段，而对侧正常关节的积液中始终无5D4片段出现，提示急性损伤可引起蛋白聚糖的降解。

国内有关蛋白聚糖相关研究较少，特别是应用单克隆抗体通过ELISA法检测蛋白聚糖代谢片段的可行性如何一直无相关报道。本研究选择可与蛋白聚糖核心蛋白区的KS链结合的Mab-5D4，通过竞争性ELISA法检测体外培养的兔膝关节软骨细胞蛋白聚糖代谢片段，计算不同酶标板的板间和板内的变异系数，了解本方法的板间差异和板内差异，判断其结果稳定性。为了更好地区分蛋白聚糖在异常条件作用下的代谢情况,本研究选择了常见的炎性因子TNF-α作为刺激因子,观察软骨细胞受刺激后蛋白聚糖的代谢情况与正常对照组的比较。

本研究结果显示，用Mab-5D4测定蛋白聚糖代谢片段的板内CV值为3.91%，板间CV值为10.38%，与既往的研究相似，均具有较好的稳定性，为可以推广应用的范围[5]。实验中TNF-α组的总体5D4片段含量明显高于对照组，说明TNF-α可刺激软骨细胞蛋白聚糖的分解。本实验同时显示用Mab-5D4测定蛋白聚糖代谢片段与GAG测定值有较好的相关性(r=0.453～0.579，P=0.001)。

在不同时间段的实验中，前3个时间段(2、4、6天)TNF-α组的5D4片段均明显大于对照组，第4时间段两组间无差别，而GAG的结果有所不同，虽然TNF-α组4个时间段的GAG结果均大于对照组，但只有第1时间段(2天)差异有统计学意义，其他3个时间段仅略高于对照组。说明本实验所测的两个指标虽然都代表蛋白聚糖的降解，有一定的相关性，但它们之间还是有所差别，可能代表蛋白聚糖核心蛋白区不同部位的降解。

本研究显示，竞争性ELISA法通过Mab-5D4测定蛋白聚糖代谢片段的方法稳定性好，重复性高，与传统的蛋白聚糖代谢指标GAG有较好的相关性，如同时应用两种方法可望能更好地进行蛋白聚糖代谢的相关研究。

1 周惠琼，张奉春.抗蛋白聚糖单克隆抗体在关节软骨代谢研究中的应用[J].中华风湿病学杂志,2007，11(8):503-505

2 Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ,etal.Monoclonal antibodies that specifically recognize neoepitope sequences generated by aggrecanase and matrix metalloproteinase cleavage of aggrecan: application to catabolism in situ and in vitro[J]. Biochem J,1995,305(3):799-804

3 Hayes AJ, Hughes CE, Caterson B. Antibodies and immunohistochemistry in extracellular matrix research[J].Methods, 2008,45(1):10-21

4 Guerne PA, Sublet A, Lotz M.Growth factor responsiveness of human articular chondrocytes: distinct profiles in primary chondrocytes, subcultured chondrocytes, and fibroblasts[J].J Cell Physiol, 1994,158(3):476-484

5 Chan SS, Kent GN, Will RK. A sensitive assay for the measurement of serum chondroitin sulfate 3B3(-) epitope levels in human rheumatic diseases[J]. Clin Exp Rheumatol,2001, 19(5):533-540

6 Struglics A, Hansson M, Lohmander LS. Human aggrecanasegenerated synovial fluid fragment levels are elevated directly after knee injuries due to proteolysis both in the inter globular and chondroitin sulfate domains[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2011, 19(8):1047-1057

7 Staffan L, Martin E, André S,etal.Association between synovial fluid levels of aggrecan ARGS fragments and radiographic progression in knee osteoarthritis[J]. Arthritis Research & Therapy, 2010, 12(6):R2308 Eya Kalai, Afef Bahlous, Nadine Charni,etal. Association of serum levels of aggrecan ARGS, NITEGE fragments and radiologic knee osteoarthritis in Tunisian patients[J]. Joint Bone Spine,2012,79(6):610-615

9 Melrose J, Isaacs MD, Smith SM,etal.Chondroitin sulphate and heparan sulphate sulphation motifs and their proteoglycans are involved in articular cartilage formation during human foetal knee joint development[J].Histochem Cell Biol, 2012,138(3):461-475

10 Lotz M,Martel-Pelletier J,Christiansen C,etal. Value of biomarkers in osteoarthritis: current statusand perspectives[J]. Ann Rheum Dis,2013,72:1756-1763

11 Struglics A,Lohmander LS,Last K,etal. Aggrecanase cleavage in juvenile idiopathic arthritis patientsIs minimally detected in the aggrecanInterglobular domainbut robust at the aggrecan C-terminus[J]. Arthritis & Rheumatism, 2012,64(12):4151-4161

(修回日期：2015-02-26)

Feasibility of ELISA for the Measurement of 5D4 Fragments in Culturedarticular Chondrocytes.

ZhouHuiqiong,ZhangQing,YeBin,etal.

DepartmentofRheumatology,TheFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China

Objective Monoclonal antibodies (Mab) of 5D4 which specifically against structural carbohydrate epitopes on the KS of aggrecan have been produced and used to detect the fragment of aggrecan which represents the abnormal metabolism of articular cartilage.Methods Articular chondrocytes were cultured with stimulated subject of TNF-α for up to 8 days.Aggrecan catabolic fragments in medium were measured by ELISA using Mab-5D4. The inter-run variability and intra-run variability were calculated. The GAG was measured by using a modification of a 1,9-dimethylmethylene blue spectrophotometric assay (DMMB) and the correlations with the results of ELISA were detected.Results The coefficient of variance of inter-run and intra-run of ELISA were10.38% and 3.91%, respectively. Fragments of 5D4 in medium of TNF-αgroups significantly increase than control (328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001).There were good correlations between the results of ELISA and GAG detected by DMMB assay(r=0.453-0.579，P=0.001). Conclusion The consistency and repeatability of ELISA to detect the fragments of 5D4 released by chondrocytes is acceptable. The method can be used in the study of metabolism of aggrecan.

Chondrocyte;ELISA;Aggrecan

首都临床特色应用研究基金资助项目(Z121107001012019)

100048 北京，解放军总医院附属第一医院风湿科(周惠琼、张清)；100029 北京，中日友好医院风湿免疫科(周惠琼、叶彬、孙晓萱、杨文芳)

周惠琼，教授，主任医师，电子信箱：13901188181@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.015

2015-01-27)