承德汉族人群大肠癌组织中MTHFR基因C677T多态性与P170糖蛋白表达的相关性

郝祥俊 高雅然 董 昕 孙 阳 孙美玉 朱 丹 郑纪宁 (承德医学院，河北 承德 067000)

多药耐药(MDR)1基因及其表达产物P170糖蛋白过度表达所介导的对抗癌药物的多药耐药性是影响化疗敏感性的重要因素〔1〕。另外也有研究证实，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是影响大肠癌以5－Fu为基础的化疗方案的关键酶。近年来关于基因多态性与大肠癌化疗敏感性的研究越来越多，然而关于亚甲基四氢叶酸还原酶基因的多态性与大肠癌化疗敏感性的研究国内尚未报道。本实验将对大肠癌组织中MTHFR基因C677T多态性与P170糖蛋白表达的相关性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 收集承德医学院附属医院2009年6～12月经外科手术切除并经病理证实的化疗前的大肠癌组织标本55例，男31例，女24例;年龄35～73岁，平均年龄56.7岁，所有患者均为首次发现大肠癌，术前均未接受化疗、放疗等治疗。大肠癌组织病理学分级按组织分化程度分为高、中和低分化腺癌，其中高分化腺癌9例，中分化腺癌40例，低分化腺癌6例。以上研究个体均为无血缘关系的承德地区汉族人。所有病例化疗前分别取组织2 cm×2 cm×1 cm和25 mg，前者放入10%中性甲醛溶液固定备用，后者放入－80℃冰箱保存。

1.2 免疫组化染色方法 标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，经脱蜡，脱苯，水化后采用 S－P法免疫组织化学方法检测大肠癌组织中P170的表达情况。一抗为鼠抗人单克隆抗体P170(1∶100)，以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。

1.3 结果判断 P170主要表达于细胞膜。光学显微镜下以细胞膜或细胞质出现均匀一致的黄色或棕黄色颗粒作为阳性反应。观察5个400倍视野，记录每个视野肿瘤细胞的染色情况，计算阳性细胞百分率，取平均值。根据试剂说明书的标准要求，阳性细胞所占百分率对表达程度进行评估，阳性细胞数小于10%定为阴性(－)，大于或等于10%定为阳性(+)。

1.4 基因多态性检测 用动物组织基因组提取试剂盒提取组织DNA，置于－30℃低温冰箱保存，备用。用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性技术(PCR－RFLP)技术检测大肠癌组织MTHFR C677T 基因型，所用引物为 5′－TGAA GGA GAAGGTATCTGCGGGA－3′和 5′－AGGACGGTGCGGTGAGAGTG－3′。 反应总体积 25 μl，含引物(25 pmol/μl)各 0.5 μl、4 × dNTP(各2.5 mmol/μl)25 μl、Tap 酶 1 U、基因组 DNA 溶液 1 μl、10 × 缓冲液(含MgCl2)2.5 μl。PCR产物用Hinfl内切酶在37℃消化3 h，用4%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色确定MTHFR C677T基因型。基因型分为野生型纯合子(C/C，198 bp)、杂合子(C/T，198/175 bp)、变异型纯合子(T/T，175 bp)三种类型。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件进行χ2检验。

2 结果

2.1 不同分化程度大肠癌组织中P170糖蛋白的表达与临床病理指标的关系 高、中、低分化的大肠癌组织中P170的阳性表达率分别为 44.4%(5/9)、52.2%(19/40)、33.3%(4/6)。P170糖蛋白在大肠癌组织中的表达与大肠癌的分化程度无相关性(χ2=0.86，P ＞0.05)。见图1。

图1 P170在不同大肠癌组织中表达情况对比(×200)

2.2 MTHFR C677T基因多态性与P170糖蛋白表达的关系C/C基因型16例，C/T基因型33例，T/T基因型6例，其中C677T T/T基因型P170糖蛋白的阳性表达率为0，显著低于C/T基因型的阳性表达率(60.6%，χ2=7.464，P＜0.05);同时又显著低于C/C基因型的阳性表达率(62.5%，χ2=6.875，P＜0.05);C/T基因型和C/C基因型之间没有相关性(χ2=0.016，P＞0.05)。见图2。

图2 基因型分析

3 讨论

大肠癌的病情发展缓慢，早期不易发现，治疗多采用手术与化疗相结合的综合治疗方法，但化疗效果不尽相同。MDR是造成化疗失败和大肠癌复发的主要原因。Yuan等〔2〕应用组织培养药敏法(HDRA)在一项针对MDR基因及蛋白表达与大肠癌化疗敏感性关系的研究中证明，MDR蛋白的表达在一定程度上和化疗敏感性密切相关，可以作为选择有效个体化化疗方案的因素。因此可以看出，P170糖蛋白的表达程度和大肠癌细胞对化疗药物的耐药性呈正相关，即P170表达阳性，就间接说明该患者对化疗药物不敏感;因此P170糖蛋白可以预测大肠癌的化疗疗效。

本实验结果说明P170糖蛋白的表达与大肠癌的分化程度无关，P170糖蛋白的表达与MTHFR基因的多态性有关，检测MTHFR C677T基因型可能成为预测化疗效果的一个重要参考指标。本实验的完成对临床制定合理的化疗方案、指导临床医生进行个体化化疗、避免不必要的化疗毒副作用具有指导作用。但由于此实验涉及的患者标本例数相对较少，尤其T/T基因型的例数更少，所以今后有必要进一步扩大病例数，对这一研究结果进行验证，以进一步提高研究结果的应用价值。

1 Ferrero JM，Etienne MC，Formento JL，et al.Application of an original RT－PCR－ELISA multiplex assay for MDRI and MRP，a long with p53 determination in node－positive breast cancer panems〔J〕.Br Cancer，2000;82:171－7.

2 Yuan SQ，Zhou ZW，Liang YZ，et al.Correlation of chemosensitivity tested using histoculture drug response as say to expression of multidrug resestence genes and proteins in colorectal cancer tissues〔J〕.Chin J Cancer，2009;28(9):932－8.