万彦彬,李观强,李朝辉
(深圳市龙岗区人民医院检验科,广东 深圳 517182)
乙型肝炎是临床常见疾病,患者发病过程中除了肝细胞中相关蛋白异常表达,还可引起血清中相关蛋白的表达增加。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)至今已发现10余个[1],它通过识别病原相关的分子模式及某些内源性配体,引发信号转导并导致炎症介质的释放,在天然防御中起重要作用,并最终激活获得性免疫系统[2]。目前研究中多为检测外周血单个核细胞中TLR的表达水平,尚未见TLR为分泌型表达的相关报道,尤其是在乙型肝炎病变中。本实验通过酶联免疫吸附实验检测血清中TLR2和TLR4的表达,探讨其表达意义及相互关系,为探讨肿瘤的生物学行为提供必要的理论依据。
1.1 一般资料 收集2010年1月至2011年12月在我院确诊为乙型肝炎患者的血清标本。共130例作为观察组,纳入标准均符合慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。本组患者中慢性乙型肝炎46例,乙型肝炎肝硬化57例,重型肝炎27例。本组中男性患者70例,女性患者60例。年龄24~69岁,平均(49.89±8.55)岁。排除标准:①近三个月有严重感染的患者;②伴有其他严重内脏器官疾病的患者;③有风湿病史的患者;④伴有恶性肿瘤的患者。收集同期体验证实为健康的成人血清60例作为对照组,其中男性40例,女性20例,年龄25~68岁。观察组与对照组在一般临床资料的比较中,无明显差别,可以进行临床比较。
1.2 TLR2和TLR4表达的检测 TLR2和TLR4 ELISA试剂盒均购自上海研吉生物科技有限公司。观察组患者在确诊为乙型肝炎后次日早晨空腹抽取静脉血5 ml,经枸椽酸钠抗凝后,以3 000 r/min离心10 min,留取血浆,于-20℃冰箱中冻存备用;对照组采血方法同上。本组均在取血后一个月内检测。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中TLR2和TLR4的表达。检测均由同一检验师操作,步骤严格按照操作说明进行,严格质控。
1.3 统计学方法 应用SAS6.12统计软件进行统计分析,两组间比较采用t检验,多组间比较应用方差分析,同时应用SNK法进行两两比较,而相关分析应用线性相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 观察组与对照组血清中TLR2和TLR4表达的比较 TLR2和TLR4在观察组血清中的表达量明显高于对照组,见表1。
表1 两组血清中TLR2和TLR4表达的比较(ng/L,±s)
表1 两组血清中TLR2和TLR4表达的比较(ng/L,±s)
注:与对照组比较,**P<0.05。
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2.2 乙型肝炎不同病变程度患者血清中TLR2和TLR4表达的比较 观察组中TLR2和TLR4在乙肝患者不同分型的比较中差异均有统计学意义,即TLR2和TLR4在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、重型肝炎中的表达依次升高,见表2。
表2 观察组中TLR2和TLR4在不同分组患者的表达(ng/L,±s)
表2 观察组中TLR2和TLR4在不同分组患者的表达(ng/L,±s)
注:经方差分析,组间比较应用SNK法进行两两比较。*组间比较差异均有统计学意义。
组别慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化重型肝炎27例数46 TLR2 74.12±11.94 t P t P 8.68 0.0019**TLR4 78.64±17.24 7.32 0.0019**57 83.43±26.35 99.67±28.53 112.33±25.53 118.60±36.46*
2.3 乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4表达的关系 经相关分析,观察组患者血清中TLR2和TLR4的表达呈正相关(P=0.021 4,r=0.39)。
TLRs作为具有免疫调节作用的物质,能有效的识别受体,包括对病原和病毒的特异性的位点的识别。也有研究认为TLRs可以形成机体免疫调节的重要防线,并通过信号转导,调节内环境中细胞合成物质的释放,而在此过程中TLR2主要针对G+杆菌、螺旋体和支原体等[3]。而TLR4作为内毒素的特异性受体,通过识别血清内毒素,与LPS/LBP/CD14结合,可以激活IRAK家族,可以成功诱导核因子的活化,进而发挥生物学作用[4]。TLR-4还可以激活靶基因转录,释放一系列细胞因子,引起肝组织细胞的广泛损伤。当机体感染肝炎病毒后,在机体清除病毒、病毒感染的慢性化及重症肝损伤的各个环节中,TLR2和TLR4的高表达均起到了重要的促进作用[5],还有研究认为TLR-2的作用可能通过与NF-κB作用实现的[6]。
本实验对收集的血清标本应用酶联免疫吸附实验进行检测,结果显示乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达明显增高,提示TLR2和TLR4在乙型肝炎发生中可能起重要促进作用。在乙型肝炎不同类型分组的比较中,我们能明显观察到慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及重型肝炎的表达依次增强,提示TLR2和TLR4在乙型肝炎病变发展中起重要作用,也提示临床中联合检测TLR2和TLR4可能是初步判断病情严重程度的重要指标。相关分析显示乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4的表达呈正相关,提示二者具有明显协同作用,并参与肝炎的发展过程。而慢性肝炎患者发病时过程中,胃肠道的黏膜出现明显的病变,引起静脉内淤血,而且肝细胞出现变性和坏死,引起蛋白产生减少,机体的免疫力低下,窦内皮细胞清除功能下降,因此对毒素的吞噬和清除功能降低,伴发内毒素血症。还有学者认为肝硬化时内毒素的表达升高,引起TLR4异常表达,对疾病进展中发挥了重要作用[7]。TLR2信号途径可能起较为重要的作用,其原因是TLR2可对病原体直接产生防御反应,从而介导天然免疫反应,并同时诱发机体继发免疫反应。鉴于乙肝患者的病情越重,TLR2的表达强度越高,也间接说明TLR2参与了乙型肝炎发病过程中的免疫损伤[8]。
总之,乙型肝炎患者血清中TLR2和TLR4高表达,二者可能具有协同作用。联合检测血清中TLR2和TLR4可能对判断病情的严重程度有重要价值。
[1]Round JL,Lee SM,Li J,et al.The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota[J].Science,2011,332(6032):974-977.
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[3]陈 煜,时红波,张 帆,等.慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞中TLR2、TLR3和TLR9的mRNA表达[J].肝脏,2010,15(4):244-246.
[4]张进祥,吴河水,王 慧,等.小鼠肝缺血再灌注后Toll样受体2在缺血肝组织中的激活及其意义[J].中国普通外科杂志,2005,14(2):114-117.
[5]Zhang Y,Lian JQ,Huang CX,et al.Overexpression of Toll-like receptor 2/4 on monocytes modulates the activities of CD4(+)CD25(+)regulatory T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].Virology,2010,397(1):34-42.
[6]Toubiana J,Rossi AL,Grimaldi D,et al.IMPDHII Protein Inhibits Toll-like Receptor 2-mediated Activation of NF-{kappa}B[J].J Biol Chem,2011,286(26):23319-23333.
[7]Chen Z,Cheng Y,Xu Y,et al.Expression profiles and function of Toll-like receptors 2 and 4 in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B patients[J].Clin Immunol,2008,128(3):400-408.
[8]郭云蔚,尉秀清,李永伟,等.慢性乙型肝炎患者肝组织中Toll样受体2的表达及其临床意义[J].新医学,2007,38(2):79-81.