心理应激对大鼠氧化应激的影响及TLR4的作用

赵咏梅，王希柱，刘宝义

(1.开滦集团有限责任公司林西医院，河北 唐山 063103；2.河北联合大学附属唐山人民医院，河北 唐山 063000)

研究表明，心理应激时经神经内分泌机制释放的应激激素能够启动或参与和炎症反应相似的调节机制，促进细胞因子的释放，引起血管壁的慢性炎症反应，即心理性刺激触发的应激反应实际上涵盖了炎症反应[1-2]，但其机制尚不明确。Toll样受体(TLRs)是一种介导炎症和天然免疫的跨膜信号转导受体家族，其中TLR4与动脉粥样硬化(AS)的发生发展及斑块稳定性关系密切[3]。本研究拟通过慢性空瓶刺激建立大鼠心理应激模型，观察各组大鼠氧化应激反应和主动脉TLR4表达并进行定量分析，初步探讨心理应激对大鼠氧化应激的影响及TLR4所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 兔抗大鼠TLR4多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔SP-9001免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TNF-α放免试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所；高速冷冻离心机(法国Jouan公司)、0725型紫外光栅分光光度仪(山东高密分析仪器厂)、光学显微镜(Olympus，日本)，HH-4型数显恒温水浴箱(北京医疗设备厂)、DHG(102)型电热干燥箱(山东潍坊医疗器械厂)、RM213转轮石蜡切片机(德国Leica公司)。

1.2 实验动物与饲养条件 健康雄性Wistar大鼠40只，体重180～200 g。由华北煤炭医学院实验动物中心提供。动物饲养于屏障系统环境下，室温18℃～21℃、相对湿度45%～55%。

1.3 动物分组与处理 将40只大鼠随机分为正常对照组(NC)、无应激组(NS)、生理应激组(PS)和心理应激组(ES)，每组各10只。ES组和PS组分别在不同的房间单笼喂养，NC组和NS组每笼5只。NS组、PS组和ES组给予高脂饮食+维生素D3负荷(一次性腹腔注射维生素D360万IU/kg)，NC组给予普通饮食+生理盐水(一次性腹腔注射等体积生理盐水)。高脂饮食配方：3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%普通饲料。

1.4 应激模型的建立 参照邵枫等[4]的方法制作心理应激模型。所有动物经一周适应性饲养后，定时喂水训练8周：每天仅在8:00～8:10和20:00～20:10给予定时饮水两次，每次10 min，其余时间不予饮水。于第8周最后一次定时饮水期间开始给予心理应激和生理应激。具体方法是ES组大鼠在原定时喂水期间不喂水并给予无规律的空瓶刺激，每天0～2次不等，使之产生慢性情绪应激。PS组大鼠在此期间亦不喂水，但也不给予空瓶刺激，目的是对比观察生理性缺水对实验的影响。应激在连续的两周内被给予14次，每次10 min。NS组和NC组大鼠继续2次/d定时饮水。整个实验周期为10周。

1.5 标本采集与观察指标 于末次应激结束后立即用10%水合氯醛(30 mg/kg)行腹腔麻醉，腹主动脉取血、静置、离心(3 000 rpm)、收集血清分装，置于-20℃冰箱保存待检。取血后取主动脉根部至主动脉弓处血管0.5 cm，4℃生理盐水冲洗、4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，用于HE染色及免疫组化测定TLR4表达(SP法)。黄嘌呤氧化酶法检测过氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)，放射免疫法测定血清肿瘤坏死因子(TNF-α)水平，操作程序严格按照试剂盒说明书进行。利用光镜(400倍)观察TLR4表达和分布情况，以血管内膜出现棕黄色者为阳性表达。每张切片随机选取4个视野，采用Micro-Optic数码医学图像分析系统分析阳性细胞单位面积平均光密度值(OD)，取平均值进行统计分析。

1.6 统计学方法 SPSS13.0统计软件包进行统计分析。实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组间计量资料的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两组间比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。

2 结果

2.1 氧化应激 ES组大鼠血清SOD活力明显低于其他三组而MDA含量明显升高；NS组、PS组血清SOD活力低于NC组而MDA含量升高；PS组与NS组比较，血清SOD活力亦降低、MDA含量升高，见表1。

表1 各组大鼠血清SOD、MDA比较（±s）

表1 各组大鼠血清SOD、MDA比较（±s）

注：同NC组比较，●P<0.05；同NS组比较，★P<0.05；同PS组比较，▲P<0.05。

组别MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)NC NS PS ES 5.58±0.22 6.31±0.18●6.56±0.22●★7.58±0.34●★▲222.31±13.61 200.71±12.91●187.22±10.28●★170.57±11.28●★▲

2.2 炎性相关因子 NC组、NS组、PS组和ES组的大鼠血清TNF-α分别为(1.772±0.0751)μg/L、(2.181±0.0847)μg/L、(2.189±0.0989)μg/L和(2.447±0.083)μg/L。ES组大鼠血清TNF-α水平明显高于其他三组；NS组、PS组亦高于NC组；PS组与NS组比较差异无统计学意义。

2.3 主动脉HE染色 光镜显示ES组大鼠主动脉出现早期AS改变：血管内膜连续性中断，内皮细胞不规则脱落，内弹力板薄厚不均匀，部分交织状排列或呈波浪状，并出现断裂分离现象，平滑肌细胞增生且与中层弹力板之间排列紊乱。其余三组未见明显形态学改变。

2.4 主动脉TLR4表达 免疫组化结果显示TLR4在NC组几乎无阳性表达，NS组、PS组、ES组均有表达，OD值分别为(0.037±0.005)、(0.238±0.015)、(0.250±0.012)和(0.334±0.010)，苏木素复染显示其主要表达于血管内膜。ES组表达强度明显高于PS组和NS组；PS组与NS组表达强度比较差异无统计学意义。

3 讨 论

本实验所采用的慢性空瓶刺激是一种与愤怒或焦虑关系更为密切的慢性心理应激模型[4]。实验结果显示，ES组、PS组、NS组均出现了明显的氧化应激反应(血清SOD活力下降而MDA含量上升)和炎症反应(血清TNF-α升高)。而ES组较其他两个处理组引起的导致血管内皮细胞损伤相关因素变化更为明显：氧化应激损伤(血清SOD活力下降而MDA含量升高)、炎症反应(血清TNF-α升高)。PS组较NS组氧化应激损伤更为明显(血清SOD活力下降而MDA含量上升)，但两组间炎症反应(血清TNF-α)差异无统计学意义。主动脉HE染色显示，ES组出现了早期AS改变，但并无动脉硬化斑块等典型AS病理变化。

研究表明，氧化应激在AS发生发展中发挥重要作用[5]。过多的活性氧不仅直接损伤血管内皮细胞，还通过信号转导系统引起炎症反应效应物的相关基因核转录，增强血管局部炎症反应。MDA反映体内活性氧水平，间接地体现氧化应激损伤的严重程度。SOD是一种抗氧化酶，发挥保护细胞免受氧化应激损伤的作用。本实验结果显示，心理应激可导致明显的氧化应激损伤，与既往研究结果一致[6-7]。NS组、PS组大鼠氧化应激反应亦较NC组明显，提示不仅是心理应激，生理应激和高脂饮食也能影响动物体内氧化和抗氧化过程的平衡，多种因素联合作用可加重机体的氧化应激损伤，进而促进AS的发生和发展。

Ross[8]指出，AS是一种慢性炎症性疾病。各种危险因素损伤血管内皮细胞，使之表达各种趋化因子和粘附分子，介导单核-巨噬细胞和淋巴细胞粘附、聚集于内膜损伤位点表面并移行增殖于内膜下。激活的内皮细胞与巨噬细胞释放TNF-α、白细胞介素(IL)-1等多种炎性细胞因子，扩大炎症反应的级联效应。ES组、PS组、NS组血清TNF-α均较NC组升高，特别是ES组升高明显，提示心理应激，生理应激和高脂饮食均能引起大鼠体内的炎症反应，而心理应激的影响更为严重。

TLR4突出的生物学活性是促进机体内炎性细胞因子的合成和释放，引发机体的炎症反应[9]。其不仅在AS斑块组织中表达强烈，慢性炎症过程亦可上调大血管组织中TLR4表达[10]。我们的实验结果显示，在出现早期AS病理改变的ES组大鼠以及没有出现明显组织学改变、但伴有氧化应激损伤和炎症反应的PS、NS组大鼠，主动脉TLR4表达均上调，提示TLR4参与了大血管早期炎性改变的发生。

Caso等[11]报道，TLR4可介导亚急性应激后脑组织的炎性反应。另有研究表明[12]，慢性应激可通过TLR4-NF-κB途径引起TNF-α等炎性因子的释放，导致心肌细胞损伤。我们通过对四组大鼠主动脉TLR4的表达强度进行统计学分析发现，ES组大鼠主动脉TLR4表达明显增强，结合我们前面的讨论，心理应激可导致与AS密切相关的氧化应激损伤和炎症反应，提示TLR4可能部分介导了心理应激导致的AS发病过程。它可能在体内环境中的某些变化(如氧化应激导致体内慢性炎症反应)和动脉形态学变化之间起桥梁作用。虽然心理应激引起AS炎症反应可能存在多方面机制，但ES组主动脉TLR4表达上调也提示，心理应激可能至少部分是通过TLR4的激活导致血管局部的炎症反应，而血管局部炎症活动是AS形成过程中最主要的特征，动脉组织中出现炎症因子表达增高可视为AS形成的一个早期信号。PS组主动脉TLR4表达较NS组无明显差异，考虑可能与生理应激的强度或实验动物数量偏少有关。

TLR4是细菌脂多糖的关键受体。Kieran等[13]研究发现，TLR4介导了脂多糖诱导的单核细胞活性氧的产生，而抗氧化剂能够抑制脂多糖所诱导的细胞因子基因靶点活化，氧化应激可以通过转录调控因子调节TLR4的表达，提示氧化应激能够影响TLR4介导的炎症反应。也有研究认为低氧可通过内皮细胞线粒体产生活性氧增多而下调TLR4表达[14]。本实验显示，心理应激在导致机体氧化应激损伤和炎症反应的同时，主动脉出现早期AS病理变化且TLR4表达增强，提示氧化应激有可能在AS形成的早期，通过激活TLR4释放TNF-α等炎性因子促进血管壁的炎症反应，进而促进AS形成。

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