葛根素联合雌二醇对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用

李 海 王金花 黄海玲 陈建海 黎 飚 (右江民族医学院组织胚胎学教研室，广西 百色 533000)

Ⅰ型骨质疏松(OP)即绝经后OP是中老年妇女的常见病和多发病，其防治已成为备受关注的课题〔1～3〕。西医用雌孕激素替代治疗效果明显，但副作用大，并发症多，中医治疗有些病例疗效不理想，任何一种药物和方法的单一使用都不尽人意。如果中西结合治疗，减少激素用量，就减少治疗的副作用和并发症〔4～7〕。目前单独用西药或中草药对绝经后OP实验室动物模型的研究较多，中药和西药同时用药的动物实验研究较少。小剂量葛根素与雌二醇(E2)对去卵巢大鼠动物模型骨组织、骨密度(BMD)影响的实验研究，为中西医结合治疗绝经后OP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 选用120只5月龄健康雌性SPF级SD大白鼠(广西医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK桂2009-002)，葛根素注射液(成都天台制药厂 100 mg/支，批号:0905053)，苯甲酸雌二醇 (100 μg/支，浙江仙居制药厂，批号:0908072)。按体重编号，手术前将120只SD大白鼠随机分成5组(n=24)，给予分笼饲养，标准饲料，自由饮水。各组大白鼠照明、通风、温度、湿度等饲养环境条件相同。

1.2 去卵巢动物模型的建立 随机取4组大白鼠用10 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉(3.0 mg/kg)，无菌条件下经腰背部双侧切口进入腹腔，切除双侧卵巢，切口分层缝合。切下的卵巢经组织学鉴定确认。术后用庆大霉素注射3 d，防止伤口感染。1 w后用药组开始用药。

1.3 假手术(sham)组的建立 手术方法与去卵巢动物模型组的手术方法相同，只切除卵巢旁的一小块脂肪垫，不切除卵巢。术后用庆大霉素注射3 d，防止伤口感染。

1.4 手术后分组 ①sham组;②去卵巢模型组(OVX);③葛根素(Pr)组;④雌二醇(E2)组;⑤葛根素(Pr+E2)组。

1.5 三个治疗组的用药 Pr组定期定量皮下注射葛根素50 mg/kg，1 次/d。E2组定期定量皮下注射 E2200 μg/kg，2次/w。Pr+E2组定期定量皮下注射小剂量 E2100 μg/kg，2次/w和小剂量葛根素25 mg/kg，1次/d。

1.6 观察的指标 ①血清E2;②血清碱性磷酸酶(AKP);③股骨BMD;④光镜下的骨组织形态结构。

1.7 观察的时间和方法 各实验组在干预后第4、8、12周和第20周随机取6只大鼠用10 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉(3.0 mg/kg)后再处死。①取左侧股骨经固定、脱钙、脱水、石蜡包埋，再切片HE染色200倍光镜观察骨组织形态结构;②取右侧股骨分离软组织后烘干用XR-600双能X光骨密度测量仪测量BMD，扫描宽度为1.5 cm，长度为4.3 cm，扫描速度为4.0 s/m。③采左心血5 ml，4 000 r/min、10 min 分离血清，保存于－20℃冰箱待测。用放免方法测定血清E2，血清AKP用比色法测定，用南京建成生物工程公司生产的磷试剂盒，722型可见分光光度计测定血碱性磷酸酶的含量，按说明书操作。

2 结果

2.1 各实验组的血清E2测量结果 见表1。OVX组第4、8、12周和第20周血E2与sham组、Pr组、E2组和 Pr+E2组相比有显著差异(P＜0.01)，Pr+E2组血E2与同时期Pr组、E2组相比无显著差异(P＞0.05)。

2.2 各实验组的血AKP测量结果 见表2。OVX组的第4、8、12周和第20周血AKP与sham组、Pr组、E2组和 Pr+E2组相比有显著差异(P＜0.01)，Pr+E2组血AKP与同时期Pr组、E2组相比无显著差异(P＞0.05)。

2.3 各实验组BMD测量结果 见表3。OVX组的第4、8、12、20周BMD明显低于同时期sham组、Pr组、E2组和 Pr+E2组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各实验组的血清E2测量结果(x ±s，ng/L，n=6)

2.4 光镜下的骨组织形态结构 sham组骨组织的骨密质较厚，骨细胞整齐排列，骨小梁结构紧密，大小均匀，骨小梁的横向联接较多。OVXXEG骨密质比较薄，骨细胞数量减少，骨小梁稀疏、纤细、大片断裂、排列紊乱，髓腔增大，钙盐沉积减少。Pr、E2和Pr+E2与去OVX组比较，OP的病理改变改善明显，骨密质增厚，骨小梁变粗，变密。三个治疗组骨组织切片光镜下的形态结构没有明显的区别见图1。

表2 各实验组的血AKP测量结果(x ±s，IU/L，n=6)

表3 各实验组BMD测量结果(±s，g/cm2，n=6)

表3 各实验组BMD测量结果(±s，g/cm2，n=6)

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图1 各组骨组织形态结构(HE，×200)

3 讨论

骨组织的成骨细胞和破骨细胞都有雌激素受体〔8，9〕，骨组织形成和溶解都受到雌激素的调节。雌激素与成骨细胞的受体相结合，促进成骨细胞胶原蛋白合成、类骨质的形成和钙盐的沉积，从而形成骨组织〔10～12〕;雌激素与破骨细胞的受体相结合，抑制破骨细胞的溶骨功能。当雌激素减少或雌激素受体与雌激素结合能力下降时，引起成骨细胞成骨功能下降，破骨细胞破骨功能增强，导致溶骨功能增强，破骨大于成骨，骨质流失，出现OP，导致OVX组股骨出现明显OP病理改变和股骨BMD明显降低。血清AKP是骨代谢最好的观察指标，去卵巢大鼠雌激素下降，骨代谢呈高转换率，所以OVX组血清碱性磷酸酶明显升高，而各个治疗组血清AKP接近正常对照组。

本文结果证明Pr和E2对去卵巢大白鼠的OP都有较好疗效。Pr对去卵巢大白鼠OP的疗效已得到大量实验所肯定〔13，14〕，葛根素主要成分是葛根异黄酮，它有雌激素样的药理作用，而没有雌激素副作用。葛根素在体内可转化为雌激素。骨组织切片能直观反映骨形态结构，是OP最客观诊断指标，BMD检查是OP临床实际诊断的金指标。本实验结果表明小剂量的Pr联合E2也能使骨密质增厚，血清E2、AKP和BMD接近正常，此治疗方案可减少雌激素用量，从而减少雌激素引起不良反应，为中西医治疗治疗绝经后OP提供实验依据。

1 Imai Y，Youn MY，Kondon S，et al.Estrongens maitain bone mass by regulating expression of genes controlling function and life span osteoclasts〔J〕.Ann NY Acad Sci，2009;1173(Suppl 1):E31-9.

2 许 洁，赵东宝，刘文斌.老年性骨质疏松症的防治进展〔J〕.中国全科医学，2010;13(4B):1246-8.

3 Setchell KD，Lydeking-Olsen E.Dietary phytoestrogens and their effect on bone:evidence from in vitro and in vivo，human observational，and dietary intervention studies〔J〕.Am J Clin Nutr，2003;78(3):593-609.

4 吴隆琦.雌激素替代治疗绝经后骨质疏松症引发的争议〔J〕.中国临床康复，2003;7(3):452.

5 周文泉，于向东.骨质疏松症的中医及中西医结合研究评述〔J〕.中国临床康复，2002;6(8):2768-9.

6 齐绍霞.小剂量雌激素预防围绝经期骨质疏松症的临床观察〔J〕.中国骨质疏松杂志，2008;14(7):517.

7 董 梅，齐宝庆.骨质疏松症的药物治疗进展〔J〕.内科，2009;4(1):98-101.

8 Bai XH.Relationship between estrogen receptor and postmenopausal osteoporosis〔J〕.J Clin Rehabili Tissue Engin Res，2008;12(37):7398-400.

9 吴小娟，李 剑，刘 芸，等.重组雌激素受体基因酵母法对南山茶子抗骨质疏松活性部位的研究〔J〕.辽宁中医杂志，2008;35(7):1060-1.

10 张久亮，郑忠志，李灵芝，等.葛根素对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007;11(36):7138-41.

11 龚海英，张 丽，郑忠志，等.葛根素对胎鼠骨骺板I型胶原蛋白表达的影响〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2008;12(33):6439-41.

12 张兆强，刘浩宇，刘锡仪.尼尔雌醇对去卵巢大鼠骨元素代谢和相关激素含量的影响〔J〕.中国应用生理学杂志，2009;25(1):129-32.

13 黄 彤，金邦荃，孙桂菊，等.葛根素对去卵巢大鼠机体骨代谢影响观察〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(10):2482-4.

14 李旭炯，张翠英.葛根素对去卵巢大鼠骨密度及血清IL-6的影响〔J〕.长治医学院学报，2009;23(1):13-5.