二氮嗪对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元氧化应激损伤的保护作用

孙锡波 高 茜 程 蕊 李炳选 刘学伍 迟兆富

(潍坊医学院附属益都中心医院神经内科，山东 青州 262500)

目前癫痫发作导致神经元损伤或死亡的分子机制仍不完全明确，亦缺乏有效的具有神经保护作用的药物。线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)是存在于线粒体膜上的一种钾通道，二氮嗪(DZ)作为其特异性开放剂，能减轻组织的缺血再灌注损伤，已在多个研究得到证实〔1～4〕。然而DZ对癫痫发作导致的神经元损伤是否具有神经保护作用，目前国内外研究还很少。本实验我们采用氯化锂-匹鲁卡品制作大鼠颞叶癫痫持续状态模型，用DZ及mitoKATP特异性阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)预处理，观察DZ对癫痫发作后海马神经元氧化应激的影响，探讨DZ对癫痫发作是否具有神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠66只，清洁级，体质量200～250 g，由山东大学实验动物中心提供，随机分为空白对照组12只，其中6只用于HE、Nissl染色，6只用于指标检测。癫痫组(PILO组)、DZ组(DZ组)、DZ加5-HD组(DZ+5-HD组)，每组18只，后3组再分为2个亚组，每亚组6只，分别用于SE后24 h、48 h指标检测，每组剩余的6只用于HE、Nissl染色。

1.2 仪器与试剂 氯化锂、匹鲁卡品、DZ、5-HD均购自美国Sigma公司;苏木素-伊红购自武汉博士德公司，甲苯胺蓝购自上海生工生物工程有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司;全基因组DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司;大鼠 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自日本Shizuoka公司。

1.3 方法

1.3.1 药物干预及癫痫模型建立 所有大鼠腹腔注射氯化锂(127 mg/kg)，20 h后给予腹腔注射匹鲁卡品30 mg/kg，在匹鲁卡品处理前30 min给予皮下注射氢溴酸东莨菪碱1 mg/kg，以拮抗匹鲁卡品导致的外周胆碱能反应。DZ组于注射匹鲁卡品前15 min给予DZ 5 mg/kg，腹腔内注射。DZ+5-HD组于注射匹鲁卡品前20 min先给予5-HD 8 mg/kg，间隔5 min后再给予DZ 5 mg/kg，二者皆腹腔内注射。对照组用等量的生理盐水代替匹鲁卡品。观察大鼠的行为学改变，以Racine评分标准为依据来判定癫痫发作级别，发作达到Ⅳ或Ⅴ级的大鼠归为实验组。如果有的小组中大鼠被排除，则即补充相应数量的大鼠，以保证每组的样本量。大鼠SE持续60 min以后，通过腹腔注射地西泮10 mg/kg以终止发作。

1.3.2 取材 分别在致痫后24 h、48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，将大鼠麻醉后，断头处死，迅速取出脑组织，在低温修块台上快速分离出双侧海马，新鲜海马组织置于－80℃保存备用，用于MDA、SOD、GSH-Px的检测及海马 DNA 8-OHdG的测定。用于HE染色及Nissl染色的大鼠于SE后48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，将大鼠麻醉后，4%多聚甲醛主动脉灌注固定，断头取脑，放入固定液中后固定24 h，取海马组织块，脱水至蜡23 h，石蜡包埋。

1.3.3 HE染色及Nissl染色 在切片机做连续冠状切片，切片厚度为10 μm，在温水槽内展片，再捞于已用铬矾明胶包被的清洁载玻片上，在切片台上烤片2 h后，4℃保存备用。切片每隔5张取2张组成1套，每套约8～10张，行HE染色及Nissl染色。将组织染色切片置于光学显微镜下，观察大鼠海马CA1区、CA3区神经元的形态及其分布。每个标本取6张染色切片，行海马神经元计数，每张切片各部位均随机观察5个视野，取其平均值。

1.3.4 MDA、SOD、GSH-Px的检测 取一侧海马组织，称重，按组织与生理盐水1∶9(W/V)的比例，置于玻璃匀浆器冰浴研磨，制备10%的组织匀浆。3 000 r/min，离心10 min，离心半径10 cm，移液管取上清液。严格按照试剂盒说明书操作，分别采用硫代巴比妥酸比色法检测海马组织中MDA的含量，WST-1法检测SOD的活力，紫外比色法检测GSH-Px的活力。

1.3.5 海马DNA 8-OHdG的测定 海马组织总DNA的提取按照试剂盒说明书操作，用8-OHdG ELISA试剂盒测定大鼠海马DNA中8-OHdG的含量，该试剂盒能测量极低水平的8-OHdG的含量，所有微板接受450 nm光密度测定。8-OHdG ELISA重复3次，取其均值。结果基于每次8-OHdG标准溶液试验的线形校正曲线计算，所得数据以每微克DNA所含的8-OHdG的皮克数表示。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，计数数据采用百分比表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较选择单因素方差分析，其中两两间比较采用最小显著差检验，率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 行为学表现 对照组大鼠无癫痫发作。PILO组致痫成功率83.33%(15/18)，DZ组的致痫率为77.78%(14/18)，DZ+5-HD组的致痫率为83.33%(15/18)，3组间无显著性差异(P＞0.05)。注射匹鲁卡品到癫痫持续状态的潜伏期PILO组为16～62 min，平均(37.83±15.64)min;DZ+5-HD组的潜伏期为19～58 min，平均(36.25±16.85)min;DZ组的潜伏期为27～96 min，平均(60.54±19.68)min。DZ组的潜伏期较PILO组以及DZ+5-HD组显著延长(P＜0.05)。致痫24 h时，15只PILO组大鼠死亡5只，死亡率为33.33%;DZ+5HD组死亡4只，死亡率为26.67%;DZ组无死亡。DZ组死亡率分别与PILO组和DZ+5-HD组差异显著(P＜0.05)。

2.2 HE染色及Nissl染色 正常对照组大鼠海马CA1区和CA3区可见大量致密的锥体细胞，排列整齐，细胞结构清晰完整，边缘清晰，细胞结构正常，染色质分布均匀，胞浆内尼氏小体丰富。SE后大鼠海马神经元损伤明显，可见部分神经元脱失，细胞排列紊乱，细胞结构不完整，胞质浓缩，核固缩，染色质凝集成块，边集，胞浆内尼氏小体减少。SE后48 h大鼠海马CA1区和CA3区存活的神经元数较对照组明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，DZ组大鼠海马CA1区和CA3区存活的神经元数目较PILO组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，DZ+5-HD组存活的神经元数目与PILO组比较无显著性差异(P＞0.05)，见表1。

2.3 MDA、SOD、GSH-Px检测 PILO组及 DZ+5HD组大鼠MDA含量在SE发作后24 h、48 h均较对照组显著升高(P＜0.05);SOD与 GSH-Px活力在SE后24 h、48 h均显著下降(P＜0.05)。DZ组大鼠，在SE后各时间点海马MDA含量均明显低于PILO组与DZ+5HD组大鼠(P＜0.05)，海马SOD与GSH-Px活力在SE后24 h、48 h时显著高于PILO组与DZ+5HD组 (P＜0.05)，见表2。

2.4 海马DNA 8-OHdG的测定 PILO组及DZ+5HD组大鼠海马DNA 8-OHdG的含量在SE发作后24 h、48 h均较对照组显著升高(P＜0.05);DZ组大鼠，在SE后各时间点海马DNA 8-OHdG的含量均明显低于PILO组与DZ+5HD组大鼠(P ＜0.05)，见表2。

表1 Nissl染色各组大鼠海马CA1和CA3区存活的锥体细胞数(个/mm2，±s，n=6)

表1 Nissl染色各组大鼠海马CA1和CA3区存活的锥体细胞数(个/mm2，±s，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05;与PILO组及DZ+5-HD组比较:2)P＜0.05

组别 CA1区 CA3区对照组238.5±23.5 257.5±24.8 PILO组 103.4±11.51) 114.6±12.81)DZ组 198.7±18.32) 218.3±22.52)DZ+5-HD组 105.6±11.21) 116.8±12.71)

表2 各组大鼠海马MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比较(±s，n=6)

表2 各组大鼠海马MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比较(±s，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05;与同时间点PILO组及DZ+5-HD组比较:2)P＜0.05

组别 MDA(nmol/mg蛋白) SOD(U/mg蛋白) GSH-Px(U/mg蛋白) 8-OHdG(pg/μg DNA)对照组 13.76±2.26 195.37±13.35 69.35±8.47 5.56±0.93 SE后24 h PILO组 23.87±3.941) 170.45±16.781) 46.58±6.341) 63.34±9.621)DZ组 18.46±2.572) 183.24±17.162) 58.86±11.252) 26.45±3.792)DZ+5-HD组 23.47±4.551) 172.48±14.581) 47.35±6.821) 61.82±9.871)SE后48 h PILO组 19.66±1.861) 160.65±17.461) 52.89±7.651) 57.68±9.111)DZ组 15.34±2.682) 175.31±13.552) 62.16±11.232) 24.83±3.362)DZ+5-HD组 18.46±2.141) 162.86±16.571) 53.62±9.451) 59.31±8.541)

3 讨论

8-OHdG是DNA氧化损伤的产物，是目前最常用的 DNA氧化损伤的检测指标之一。MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化反应的程度，并间接反映引起脂质过氧化反应的自由基的水平。癫痫发作时通过脂质过氧化与氧化应激损伤可损伤线粒体的功能与结构，影响呼吸链，进一步增加ROS的生成，从而形成恶性循环，最终可导致细胞坏死或者凋亡〔5〕。

本研究结果表明大鼠SE后海马神经元存在氧化应激损伤，并可能成为治疗靶点。在缺血再灌注动物模型中mitoKATP开放剂DZ、吡那地尔等均可模拟缺血预处理的保护作用，mitoKATP阻断剂5-HD可阻断这种保护作用。关于mitoKATP开放剂对神经元保护作用的机制目前尚未完全明确，Teshima等〔3〕学者研究认为，mitoKATP通过维持线粒体膜电位而抑制神经元凋亡从而起到神经保护作用。Sun等〔4〕研究肾脏的缺血再灌注模型后提出，mitoKATP可通过抑制线粒体生成过多的ROS从而抑制细胞凋亡，起到保护脏器功能的作用。Roseborough等〔6〕研究兔脊髓缺血模型认为，mitoKATP开放剂DZ通过降低内源性ROS的产生，保护线粒体结构的完整性，改善缺血脊髓的功能。还有的学者〔7〕认为，mitoKATP开放剂通过防止线粒体肿胀，限制Ca2+的内流，抑制细胞色素C的释放而起到神经保护作用。

尽管如此，DZ是否对癫痫发作以及癫痫发作导致的脑损伤具有保护作用及其可能作用机制还知之甚少。本研究结果表明mitoKATP开放剂DZ能减轻大鼠SE后海马神经元的氧化应激损伤，对SE后海马神经元有保护作用。我们用5-HD后可拮抗DZ的神经保护作用，进一步证明了DZ是通过开放mitoKATP起神经保护作用的。本研究结果提示开放mitoKATP可能为癫痫的神经保护提供新的前景。

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4 Sun Z，Zhang X，Ito K，et al.Amelioration of oxidative mitochondrial DNA and deletion after renal ischemic injury by the KATP channel opener diazoxide〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2008;294(3):491-8.

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