亚氯酸钠对鲜烟酶促棕色化反应的影响

任 杰，张勤玉，赵晓超，孙福山*，任百战，程 森，赵 鹏，高 远，肖头杰，徐世峰

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛 266101；2.陕西富安生物科技有限公司，陕西宝鸡 721013；3.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040；4.陕西省烟草公司延安市公司，陕西 延安 716000；5.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082；6.陕西省烟草公司安康市公司，陕西 安康 725000）

酶促棕色化反应导致烤烟颜色在烘烤过程中由黄色变为不同程度的褐色，是挂灰、蒸片等杂色形成的重要原因之一，严重影响烟叶的商品等级和使用价值。在烤烟烘烤过程中为防止酶促棕色化反应，减少烟叶褐变，人们多通过完善烘烤办法来实现，但该法复杂、繁琐、可操作性差。因此许多研究者试图利用各种抑制剂专一地调控酶促棕色化反应。已经证明胱氨酸[1]、L-半胱氨酸[2]、PVP[3]、硫脲[2-4]、铜试剂（NaDiCa）[4-5]、EDTA[3-5]、钼[6-7]等均能在一定程度上抑制烟草酶促棕色化反应，但这些抑制剂或成本太高或具有很大毒性[4]，实际应用存在一定局限性。

亚氯酸钠（sodium chlorite，SC）是一种强氧化剂，以前主要用于食品的杀菌消毒。但是近几年在食品上的研究发现，SC除能杀灭食品中的病原微生物外，也能抑制食品中的酶促棕色化反应的发生，一举两得[8-12]。最近研究发现SC可能是通过抑制 PPO活性而直接抑制酶促棕色化反应或通过氧化分解绿原酸等酶促棕色化反应的底物而减少酚类物质向醌类物质的转化从而降低酶促棕色化反应的发生[10]。此外，美国食品及药品管理局（FDA）已经批准在一定浓度范围内在果品和蔬菜上使用亚氯酸钠。调控烟叶烘烤过程中酶促棕色化反应的发生和烟叶表面病原微生物的生长是确保烟叶烤后质量的重要方面，但是有关SC对烤烟酶促棕色化反应的影响在国内外均未见报道。本研究旨在探讨亚氯酸钠对鲜烟酶促棕色化反应的影响，以期为合理调控烟叶酶促棕色化反应提供新依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为K326。试验于2011年在陕西省旬阳县丰家岭标准化烘烤工场进行。

1.2 试验设计

取最容易发生棕色化反应的上二棚烟叶，进行下列试验：

1.2.1 不同浓度SC对鲜烟酶促棕色化反应的影响采收上二棚成熟一致鲜烟20片（16～18叶位，5～6成黄绿），每5片一组，分别用100 mg/L（T1处理）、200 mg/L（T2处理）、300 mg/L （T3处理）SC（均加入黏着剂吐温-20，终浓度为 0.1%）喷施处理，以喷施清水处理为对照（CK）。按照行标YC/T 311—2009规定的“暗箱试验”，每12 h 观察记载烟叶自然条件下变黄（Y）、变褐（B）成数。

1.2.2 SC不同处理方式对鲜烟酶促棕色化反应的影响 采收上二棚成熟一致鲜烟10片（16～18叶位，5～6成黄绿），每5片一组，用最佳浓度SC处理，处理方式为喷施（P处理）和浸泡（J处理）。浸泡处理时间为2 min。按照“暗箱试验”，每24 h观察记载烟叶自然条件下变黄（Y）、变褐（B）成数。

1.2.3 SC对不同成熟度鲜烟酶促棕色化反应的影响 采收上二棚5～6成黄绿、7～8成黄绿、9～10成黄绿不同成熟度鲜烟各5片，用最佳浓度SC处理，处理方式为喷施。按照“暗箱试验”，每24 h观察记载自然条件下烟叶变褐成数。

另取成熟一致鲜烟20片，每10片一组，用SC最佳浓度、喷施处理，以清水为对照，按照“暗箱试验”每天定时取样，-20 ℃保存备用。

1.3 样品测定

1.3.1 样品PPO活性测定 采用文献[13]的方法，以每克烟叶样品每分钟内OD420变化0.01为1个酶活力单位（U）。

1.3.2 变黄指数、变褐指数 按文献[14]的方法，在测定时间内，定时的测定次数（n）、变黄成数（Y）、变褐成数（B）以求得变黄指数（Yellowing Index，YI）和变褐指数（Browning Index，BI）。YI=∑Y/n，指数值愈大，变黄愈快。BI=∑B/n，指数值愈大，变褐愈快。

2 结 果

2.1 SC浓度对鲜烟变黄和变褐速率的影响

由图1可以看出，在36 h前，烟叶变黄速率不同浓度SC间无显著差异。36 h后，表现出随浓度增大烟叶变黄加快的趋势。总体来看，随着SC浓度的增大，烟叶变黄指数略微增大（表1）。但是300 mg/L SC处理（T3）24 h后烟叶出现药害。

从图1还可看出，SC抑制了酶促棕色化反应的发生，对照烟叶在采后60 h并未完全变黄（8成黄绿）时即已开始发生褐变，而100 mg/L SC 处理（T1）烟叶在采后84 h变黄达9成黄时开始褐变，较对照晚24 h。200 mg/L SC处理（T2）在采后96 h烟叶变黄即已达10成黄，而在108 h即烟叶完全变黄12 h之后才开始出现褐变，较对照推迟了48 h。但300 mg/L SC处理烟叶褐变速率与对照却无显著差异，这可能与此浓度SC处理烟叶发生药害有关。从变褐指数来看，CK为1.5，而T1和T2处理分别为0.8和0.3，大大低于对照，但随浓度增大T3处理又上升为1.1（表1），这说明在一定浓度范围内SC能抑制烟叶酶促棕色化反应，但浓度超过一定范围（＞300 mg/L）烟叶发生药害，抑制作用消除。

图1 不同浓度SC对鲜烟酶促棕色化反应的影响Fig.1 Effects of different concentrations of SC on enzymatic browning reaction of tobacco leaves

表1 不同浓度SC处理烟叶变黄指数、变褐指数Table 1 Yellowing Index and Browning Index of tobacco leaves treated with different concentrations of SC

2.2 SC不同处理方式对鲜烟变黄和变褐速率的影响

采用喷施和浸泡两种方式，200 mg/L SC对烟叶进行处理，每24 h观察一次。从图2a可以看出，喷施和浸泡两种方式处理烟叶变黄速率并无显著差异，均在采后96 h基本完全变黄。从图2b可以看出，两种处理方式对烟叶酶促棕色化反应的影响也无显著差异，均在采后120 h出现褐变。两种方式处理烟叶从完全变黄至烟叶开始褐变相差24 h，为烟叶变黄后的定色提供了充足的时间。

图2 SC不同处理方式对鲜烟变黄（a）和变褐（b）速率的影响Fig.2 Effects of different treatment methods of SC on yellowing (a) and browning (b) rates of tobacco leaves

2.3 SC对不同成熟度鲜烟变褐速率的影响

不同成熟度烟叶多酚氧化酶活性不同，酶促棕色化反应发生程度差异较大，因此不同成熟度烟叶烤后质量也有很大差别[15]。从图3可以看出，SC对不同成熟度烟叶酶促棕色化反应的发生均有一定的抑制效果，但不同成熟度之间差异较大。SC处理M2成熟度烟叶在达到完全变黄之后（72 h）即出现褐变，SC处理M1成熟度烟叶经96 h完全变黄，120 h出现褐变，中间相隔24 h。SC处理M3成熟度烟叶经48 h完全变黄，96 h出现褐变，中间相隔48 h。SC对不同成熟度鲜烟酶促棕色化反应的抑制效果为M3＞M1＞M2。

2.4 SC对鲜烟PPO活性的影响

从图4可以看出，SC处理和对照烟叶PPO活性变化表现出相似的变化趋势，但SC处理烟叶PPO活性均低于同期对照处理烟叶。对照处理烟叶PPO活性采后逐渐升高，在48 h达到一个小高峰，之后轻微下降并维持在同一水平，采后120 h之后则迅速上升，采后144 h达到最大。SC处理烟叶PPO活性采后24 h略有上升，48 h有所下降，之后则缓慢上升，至采后144 h达到最大。

图3 SC对不同成熟度鲜烟酶促棕色化反应的影响Fig.3 Effects of SC on enzymatic browning reaction of different maturity tobacco leaves

图4 SC对鲜烟PPO活性变化的影响Fig.4 Effects of SC on PPO activity changes of tobacco leaves

3 讨 论

亚氯酸钠因具有杀菌、抑制酶促棕色化反应双重功效而成为近年来广受关注的新一代保鲜剂和杀菌剂，它安全、高效、广谱、无毒副残留，可广泛应用于食品、医疗、环境、饮水等领域[8]。在对烟叶酶促棕色化反应抑制方面，SC表现出随浓度增大而增强的趋势，但是当SC浓度超过300 mg/L时，抑制作用反而下降。在苹果鲜切片上也表现出相似的现象，这可能是因为高浓度的SC对组织造成了损害[9]。在烟叶烘烤过程中，当烟叶全部变黄，表明叶内物质分解转化已达适宜程度，应使叶片水分大部分失去，使酶的活动基本停止。如果不能及时定色，则会使烟叶色泽不鲜或局部挂灰。但是从图1可以看出对照处理烟叶在未完全变黄之前即已经开始褐变，并没有为烟叶及时定色提供时间，而200 mg/L SC处理烟叶在完全变黄后12 h才出现褐变，这12 h为烟叶完全变黄后的及时定色提供了充足的时间，使获得高质量的烤后烟叶成为可能。

叶片浸泡的抑制效果能在较短的时间内即显现出来，不同时间的抑制剂处理对烟叶中多酚氧化酶的活性影响不大[4]。因此，采后叶片浸泡处理和喷施处理本质上是相同的，所以采后喷施处理和浸泡处理对酶促棕色化反应的抑制效果并无显著差异。成熟度与烟叶烤后质量关系密切，不同成熟度烟叶烤后质量差异巨大，本研究结果说明SC对采后不同成熟度烟叶处理效果不同，其中以M3成熟度效果最好，M1次之，M2成熟度效果最差，这可能与不同成熟度烟叶采后PPO活性有关，有研究表明上部叶鲜烟PPO活性在达到成熟之前逐渐升高，成熟期达到最高，而在充分成熟后PPO活性又急剧下降[16]。

酶促棕色化反应与PPO活性密切相关，抑制烟叶PPO活性也是调控酶促棕色化反应的主要措施。而SC也显著抑制了烟叶PPO活性。在生物组织内，PPO活性位点与铜离子结合，在棕色化反应中Cu2+和 Cu+保持动态平衡[17]，而随着 Cu2+浓度的增加PPO活性下降[18]，而最近也有研究指出SC可能就是通过将Cu+氧化成Cu2+而调控PPO活性[10,19]。此外，烟叶中的主要多酚化合物如绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚 3个不稳定部分。在酸性条件下 SC能将绿原酸氧化分解为咖啡酸和奎宁酸，而在偏碱性条件下则SC能将绿原酸氧化为相应的醌，而在SC存在的条件下所形成的醌并不能进一步聚合形成色素，相反，通过一段时间的反应后醌也被氧化降解[10]。因此，SC对酶促棕色化反应的抑制可能是通过直接抑制 PPO活性和氧化降解多酚底物或中间产物醌而进行的。SC对酶促棕色化反应抑制的机理不同于还原剂类、螯合剂类、络合剂类以及底物竞争性抑制剂。

4 小 结

综上所述，200 mg/L SC能显著降低鲜烟PPO活性，抑制鲜烟酶促棕色化反应，特别是对充分成熟的上二棚烟叶效果更为明显。但本实验只是通过暗箱试验就SC对烤烟酶促棕色化反应的抑制效果进行初步研究，有关SC对酶促棕色化反应的抑制机理及其对烟叶烘烤质量的影响有待于进一步研究。

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