丹红注射液预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞损伤的影响

郑亚萍 韩 坤

漯河医学高等专科学校生理教研室，河南 漯河 462002

心肌缺血再灌注损伤 （isehemia-reperfusioninjury，I/R）是心脏缺血性疾病及心外术后心肌损害的主要原因，其导致的心肌细胞凋亡被认为是再灌注损伤的重要环节。丹红注射液是由丹参与红花萃取制备而成，具有保护心血管的作用，已有动物实验提示丹红注射液对大鼠离体心脏缺血再灌有保护作用[1]，但其对缺血再灌心肌细胞的直接作用的报道较少。本研究采用心肌细胞缺血再灌注细胞模型，观察丹红注射液预处理对其的影响，初步研究其作用的可能机制。

1 仪器与试药

1.1 实验动物

出生2～3 d的SD大鼠。

1.2 试剂

丹红注射液 （济南步长制药有限公司，批号：Z20026866），胰蛋白酶、DMEM 培养基（均为 Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司），鼠抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体、抗Bcl-2、抗Bas（均为博士德公司），其余试剂均为市售分析纯。

1.3 心肌细胞培养、鉴定

取2～3 d的SD大鼠，在无菌条件下取出心室，剪碎，0.1%胰酶消化，收集细胞，离心，重悬，置于二氧化碳培养箱中孵育。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间不同，采用差速贴壁1.5 h，获得心肌细胞。免疫组化染色观察α-横纹肌肌动蛋白反应。

1.4 缺血再灌注体外模型的建立

将培养的心肌细胞更换无血清培养基，缺氧培养箱（95%N2、5%CO2）中培养3 h后，置10%胎牛血清DMEM 培养基，常规培养9 h。

1.5 实验分组

将心肌细胞按照2×105/mL均匀的接种于24孔板中，丹红组分别以2%、4%、8%、16%的给药浓度[1]，实验共分6组，每组5个孔，即：①正常对照组（用无胎牛血清的高糖DMEM培养液）；②缺血再灌注（I/R）组；③I/R+丹红注射液（2%）组；④I/R+丹红注射液（4%）组；⑤I/R+丹红注射液（8%）组；⑥I/R+丹红注射液（16%）组。

1.6 流式细胞仪检测凋亡率

0.25 %胰蛋白酶消化各组心肌细胞，用4℃预冷的PBS洗涤2次，离心5 min，重悬细胞，于70%冷乙醇（4℃）过夜。检测时离心10 min（1 000 r/min），PBS洗去乙醇。细胞沉淀用碘化丙啶（PI）4℃避光染色30 min，上机检测。G期前的亚二倍体峰即代表凋亡峰，反映凋亡细胞的百分比。

1.7 Bas、Bcl-2基因蛋白表达

各组心肌细胞爬片，固定，在室温下用3%H2O2处理30 min以灭活过氧化物酶，后加入Bcl-2、Bax抗体4℃过夜，加入冲洗后依次加入1∶100生物素化山羊抗兔IgG和1∶100抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物液，DAB染色，复染，脱水，透明后封片。细胞浆显示棕黄色颗粒细胞为阳性细胞，将玻片于光学显微镜下放大200倍，根据阳性细胞分布情况，每片选择10个视野，每视野计算Bcl-2、Bax蛋白阳性表达的细胞数，以平均计算阳性细胞数所占百分比作为Bcl-2、Bax蛋白蛋白阳性表达指数。

1.8 统计学方法

采用SPSS 11.5软件包进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下心肌细胞鉴定结果

心肌细胞鉴定光镜下观察，心肌细胞接种72 h可见细胞形态不规则，呈梭形，三角形或多边形，单核，有多个伪足伸出，形成细胞簇；免疫组化染色显示，α-横纹肌肌动蛋白呈阳性反应，阳性率达90%以上。

2.2 流式细胞仪检测结果

结果显示，缺血再灌组细胞凋亡率表达明显高于对照组，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；与I/R组比较，用丹红注射液预处理后呈浓度依赖性地下调凋亡率 （P＜0.05或P＜ 0.01）。 见表 1。

表1 丹红注射液对心肌细胞凋亡率的影响（，%）

表1 丹红注射液对心肌细胞凋亡率的影响（，%）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与I/R组比较，#P＜0.05，##P ＜ 0.01

组别 心肌细胞凋亡率正常对照组（n=5）I/R 组（n=5）I/R+丹红注射液（2%）组（n=5）I/R+丹红注射液（4%）组（n=5）I/R+丹红注射液（8%）组（n=5）I/R+丹红注射液（16%）组（n=5）6.12±1.25 54.18±9.26**42.23±3.57**#36.19±3.82**#29.33±2.85**##19.45±2.53*##

2.3 Bas、Bcl-2 蛋白的表达

结果显示，缺血再灌组细胞Bas表达明显高于对照组，Bcl-2表达则显著低于对照组，差异均有高度统计学意义（均P＜0.01）；而与I/R组相比，用丹红注射液预处理后呈浓度依赖性的下调凋亡率及Bas表达，上调Bcl-2表达（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

3 讨论

缺血心肌的早期再灌注治疗能减轻缺血损伤，使细胞凋亡下降，减小梗死面积，缺血较长时间后再灌注反而会引起再灌注损伤，造成细胞凋亡明显增加，因而心肌细胞凋亡被认为是再灌注损伤的重要环节[2]。丹红注射液目前已用于临床治疗冠心病，且对离体大鼠缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用，此作用可能与抑制心肌脂质过氧化、增强抗氧化能力及调控凋亡基因有关[3]。

表2 丹红注射液对心肌细胞Fas、Bcl-2蛋白表达的影响（，%）

表2 丹红注射液对心肌细胞Fas、Bcl-2蛋白表达的影响（，%）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与I/R组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 Bas蛋白 Bcl-2蛋白正常对照组（n=5）I/R 组（n=5）I/R+丹红注射液（2%）组（n=5）I/R+丹红注射液（4%）组（n=5）I/R+丹红注射液（8%）组（n=5）I/R+丹红注射液（16%）组（n=5）5.85±0.94 31.12±5.39**25.46±4.25**#22.14±3.98**#18.45±3.13**##9.45±2.44*##46.45±6.87 13.08±4.26**19.52±5.12**#24.35±4.89**#30.34±3.73*#36.14±3.97*##

Bcl-2、Bas基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因，Bcl-2基因可抑制许多因素引起的细胞凋亡，被称为细胞凋亡抑制基因，Bas单克隆抗体在体内与Bas结合后均能导致表达Bas的细胞发生凋亡，从而证明Bas是一种识别Bas配体，并将凋亡信息传递给细胞的细胞表面受体[4-5]。本实验结果显示，心肌缺血再灌能促进心肌细胞凋亡，且伴随着Bcl-2基因表达蛋白的明显降低和Bas基因表达蛋白的明显升高；而丹红注射液则能呈浓度依赖性地下调心肌细胞的凋亡率，并伴有Bcl-2基因表达蛋白的上调和Bas基因表达蛋白的下调。

大鼠心肌缺血再灌注过程中，Bcl-2蛋白表达减少而Bas蛋白表达增加，表明心肌细胞凋亡可能是一方面Bcl-2蛋白表达降低，抗凋亡能力减弱，而另一方面Bas蛋白表达增加，发挥了促凋亡能力的缘故[6]。丹红注射液则可通过上调Bcl-2蛋白表达的和下调Bas蛋白表达，发挥保护缺血再灌心肌细胞的作用，这也为临床上应用丹红治疗心肌缺血再灌注损伤提供分子调控依据。

[1]郄素会，郝哲，刘增娟，等.丹红注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].现代中西医结合杂志，2008，35（17）：5428-5430．

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[3]周晓枫．丹红注射液与硝酸甘油联用治疗不稳定心绞痛疗效观察[J]．中国医药导报，2007，4（14）：65．

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[5]郑勇萍，王焱林，陈锋，等．大鼠心肌缺血预处理对细胞凋亡的影响[J]．中华中医学杂志，2002，26（5）：265-266．

[6]Mukherjee S，Lekli I，Das M，et al．Cardioprotection with Alpha-tocopheryl phosphate：Amelioration of myocardial ischemia reperfusion injury is linked with its ability to generate a survival signal through Akt activation[J]．Biochim Biophys Acta，2008，1782（9）：498-503．