HPLC法测定大鼠血浆中色胺酮的浓度及药代动力学参数

2012-07-28 09:57王四旺王剑波谢艳华
中国药理学通报 2012年2期
关键词:药代灌胃内标

李 捷,缪 珊,王四旺,王剑波,谢艳华

(第四军医大学药学院天然药物学教研室,陕西西安 710032)

色胺酮(tryptanthrin)为吲哚喹啉类生物碱,其化学名称为吲哚[2,1-b]喹唑啉-6,12-二酮(6,12-dihydro-6,12-dioxoindolo-[2,1-b]-quinazoline),结构式见Fig 1。主要存在于马蓝(Strobilanthes cusia)、蓼蓝(Polygonum tinetorium Lour)、菘蓝(Isatis tinctoria L.)等产蓝植物中,现也可通过微生物发酵或人工合成得到[1]。近年来药理研究表明其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗疟和杀虫作用,特别是可以通过多种途径对肿瘤细胞增殖有抑制作用。据报道,蓼蓝中的色胺酮能诱导白血病细胞凋亡[2];Kimoto等[3]也观察了色胺酮在体外对多种人白血病细胞的杀细胞作用;另有研究表明,色胺酮在低浓度可诱导白血病细胞分化,高浓度可通过caspase-3或Fas抗原途径诱导凋亡,从而引起细胞的死亡;Mu[4]研究发现呈浓度依赖性抑制培养的肿瘤细胞的DNA合成;Motoki等[5]发现,色胺酮通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的下游区域来抑制肝细胞生长因子的生成,从而抑制肿瘤细胞的恶化、侵袭、生长和转移;Sharma等[6]合成了多个色胺酮衍生物,并筛选这些化合物对体外8种、体内12种人类肿瘤细胞株的杀伤活性,结果显示大多数化合物具有细胞毒活性;Koya-Miyata等[7]的实验表明,通过预防性给予色胺酮,可降低肠道肿瘤的发生率;缪珊等[8]研究发现色胺酮还能明显抑制 MCF-7细胞增殖并具有诱导细胞发生凋亡的作用;还能影响人白血病细胞株K-562细胞的增殖和凋亡[9]。但是,色胺酮在体内的药动学研究鲜有报道。为给色胺酮的进一步研究和应用提供依据,本文采用HPLC法建立了大鼠血浆中色胺酮的测定方法,并测定大鼠灌胃给予色胺酮后经时血药浓度,研究其在大鼠体内的药代动力学特征。

Fig 1 Chemical structure of tryptanthrin(a)and internal standard cinnamaldehyde(b)

1 材料

1.1 仪器 日本岛津高效液相色谱(HPLC)仪,配有LC-20AT二元泵,SPO-M20A型二极管阵列检测器,SIL-10AF自动进样器,CTO-10AS型柱温箱;KQ-300VDE型双频数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(德国赛多利斯);XK-96A快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司);TGL-16GB高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);Scietnz 192高通量组织研磨机(宁波新芝生物科技股份有限公司);SIMENSBCD-601W无菌冷藏冷冻冰箱(博西华家用电器有限公司);Millipore超纯水器(密理博上海贸易有限公司);IVC独立换气系统(上海邵丰实验动物设备有限公司)。

1.2 试药 桂皮醛对照品(批号110710-200212)购于中国药品生物制品检定所(纯度均大于98%),肝素钠(西安阿尔宝生物技术有限责任公司),色胺酮由西北大学生命科学院提供(纯度大于98%),乙腈(SK chemicals,Korea),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠,体质量(280±20)g,由第四军医大学试验动物中心提供,许可证号SCXK-(军)2007-007。

Fig 2 HPLC chromatograms of the assay

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm),流动相为乙腈 -水(47∶53),流速1.0 ml·min-1,检测波长 251 nm,柱温 30℃,进样量 20 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取适量色胺酮对照品,加入乙腈稀释配制成质量浓度为585.6 mg·L-1的储备液。精密吸取适量,用乙腈分别稀释成浓度为 11.712、5.856、2.928、0.723、0.183 mg·L-1的标准系列溶液,均于4℃保存,备用。

2.2.2 内标溶液的配制 精密称取桂皮醛对照品,用甲醇溶解并稀释至质量浓度为20 mg·L-1,即得内标工作液,均于4℃保存,备用。

2.2.3 灌胃溶液的配制 称取色胺酮原料药适量,用0.5%CMC-Na溶液助悬,配制成浓度为5.6 mg·L-1的混悬液,灌胃时磁力搅拌,使呈均匀的混悬状态。

2.3 血浆样品预处理 取血浆样品200 μl,加入内标桂皮醛溶液20 μl和乙腈500 μl,涡旋混合1 min,再在12 000×g离心15 min,取上清液,即得。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察 取大鼠空白血浆、空白血浆加对照品、灌胃后血浆样品,按照“2.3”项下方法处理,进样后所得色谱图见Fig 2。结果表明,本实验条件下,色胺酮与内标峰分离良好,无杂质干扰。

2.4.2 标准曲线的制作和最低定量限考察 分别吸取“2.2.1”项下的系列标准溶液20 μl,加入200 μl空白血浆中,配制成相当于色胺酮浓度分别为0.0183、0.0723、0.2928、0.5856、1.1712 mg·L-1的血浆样品。按“2.3”项下操作,以血浆中色胺酮的质量浓度为横坐标(X),以色胺酮和内标峰面积的比值为纵坐标(Y),用最小二乘法回归运算,得到直线回归方程为 Y=3.608 5X-0.082 1,r2=0.999。结果表明色胺酮质量浓度在0.0183~1.1712 mg·L-1线性关系良好。按以上条件测得血浆中色胺酮的最低定量限为0.02 mg·L-1。

2.4.3 准确度、精密度考察 按“2.3”项下操作,制备低、中、高 3个浓度(分别为 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L-1)的质量控制样品(Quality control QC),每个浓度分别制备6个样本,重复3个分析批,以当日的标准曲线计算QC样品的测得浓度,与配制浓度比较,得到本方法的准确度和精密度。连续检测3 d,结果表明,日内、日间精密度分别为2.15%~3.05%和4.62% ~6.80%。试验数据表明,测定大鼠血浆中色胺酮的分析方法符合中国国家食品药品监督管理局(State Food and Drug Administration,SFDA)有关的临床前药代动力学研究的指导原则要求。

2.4.4 稳定性考察 经考察低、中、高3个浓度(分别为0.0732、0.2928、0.5856 mg·L-1)色胺酮在反复冻融3次,-20℃贮存15 d,室温放置4 h条件下的RSD分别在3.54% ~8.77%、3.79% ~9.05%、4.21% ~9.20%(n=6),说明在测定条件下样品稳定。

2.4.5 提取回收率 以对照品溶液配制方法,配制成色胺酮低、中、高 3个浓度(分别为 0.0732、0.2928、0.5856 mg·L-1)的对照品溶液,再取大鼠空白血浆200 μl,用一定浓度的色胺酮对照品配制成相应浓度的色胺酮血浆样品,按“2.3”项下操作,每一样品进行6样本分析,以血浆中色胺酮的峰面积与对照品溶液的峰面积的比,评价本方法的提取回收率。色胺酮在低、中、高3个浓度下的血浆样品提取回收率分别为97.04%、95.26%和97.89%。结果见Tab 1。

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s,n=6)

Tab 1 Recovery of the assay for tryptanthrin in rat plasma(±s,n=6)

Plasma concentration/mg·L-1Extraction recovery RSD/%0.0732 95.26 ±1.04 1.08 0.2928 97.04 ±0.56 0.58 0.5856 97.89 ±9.48 0.49

2.5 色胺酮在大鼠体内的药代动力学

2.5.1 样本的采集与处理 SD大鼠♀♂各5只,实验前适应性喂养2 d,给药前12 h至实验期间禁食不禁水。按56 mg·kg-1单剂量灌胃[10],分别于给药前和给药后 1、2、3、4、6、8、10、12、23 h 眼眶取血0.5 ml,置于肝素化PE管中,轻微振摇后4 000×g离心15 min,取血浆于-20℃保存,备用。

2.5.2 血药浓度-时间曲线关系及药代动力学参数 灌胃给药后,色胺酮在♀♂大鼠体内的平均药时曲线见Fig 3。血药浓度数据采用DAS 2.1.1软件进行分析,色胺酮的体内过程符合二室开放模型,以药物半衰期(T)、达峰浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)和药时曲线下面积(AUC)等参数表征该药物的药动学特征,结果见Tab 2。

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s,n=5)

Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of tryptanthrin after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1to female and male SD rats(±s,n=5)

Parameters Unit Female Male Mean SD T Mean SD 1 2β h 10.73 14.28 10.17 15.79 K21 h-1 0.221 0.198 0.323 0.238 K10 h-1 28.25 54.74 3.421 3.587 K12 h-1 0 0 0 0 Cmax mg·L -1 1.887 1.093 2.620 0.538 Tmax h 5.200 1.095 4.600 1.342 MRT0→∞ h 9.041 2.176 8.310 2.236 Vz/F L·kg-1 37.68 42.75 34.78 30.92 T h 1.503 0.877 1.279 0.285 T 1 2α 1 2z h 4.314 2.610 5.597 4.694 AUC0→∞ mg·h·L -1 12.51 5.285 14.70 3.310 CL L·kg-1·h-15.752 2.960 3.982 0.999

Fig 3 Mean plasma tryptanthrin concentration versus time profiles after oral administration at a single dose of 56 mg·kg-1 in male(A)and female(B)SD rats(n=5)

3 讨论

优化HPLC色谱条件时,比较了流动相不同比例的甲醇 - 水[11-12]、乙腈 - 水,结果乙腈 - 水(47∶53)时内标物和色胺酮的保留时间恰当,峰形良好,血浆内源性物质及其他杂质不干扰样品的分离测定。检测波长的选择时,对色胺酮进行全波长扫描,结果251 nm时吸收最大,最终确定251 nm为检测波长。内标选择时,曾试过靛蓝和靛玉红做内标[13],但由于在相同的色谱条件下,较短时间内很难得到理想分离度和峰形,而桂皮醛的色谱行为与色胺酮相似,在较短时间内能很好的分离,并且提取回收率相近,故选择桂皮醛为内标。

样品制备时,比较了甲醇沉淀蛋白和乙腈沉淀蛋白,分别用乙酸乙酯、三氯甲烷萃取后4 000×g离心,结果在色谱峰中均有保留时间较长的色谱峰影响当前样品或下一样品的分析。后又改用500 μl乙腈沉淀蛋白,并直接12 000×g高速离心,结果样品中被测峰和内标峰分离度均较好,并且对当前样品和下一样品均没干扰,故终确定了文中的处理方法。经在药代动力学研究中的应用,验证了本文所建色胺酮HPLC的检测方法在非临床药代动力学研究中的适用性,为其非临床药代及毒代动力学等安全性研究提供了可靠的分析方法。

考察拟开发新药是否有发展前途,优良的药代动力学参数是重要的指标之一。从实验结果看,灌胃给予色胺酮后,其在♀和♂大鼠体内的Tmax均较大,分别为5.2 h和4.6 h,T12分别为4.3 h和5.6 h,提示色胺酮在大鼠体内吸收和消除均较缓慢;K12,K10,K21分别表明色胺酮主要从中央室消除和从周边室向中央室转运,并且分布广泛;表观分布容积(AUC0→∞)分别为 12.5 和 14.70 mg·h·L-1,也提示色胺酮在大鼠体内分布广泛。血药浓度-时间曲线数据显示,色胺酮能在血液中较长时间保持一定血药浓度,属于一种长效机制,但是否会引起长期蓄积毒性反应,还有待于今后深入研究。

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