热休克蛋白90在氯化钴对抗血清-葡萄糖剥夺引起的心肌细胞损伤中的作用

何金莲，董 颀，林春喜，张 梅，王秀玉，郭润民，沈 宁，冯鉴强，杨春涛

(1.广东省人民医院，广东省医学科学院，广东省老年医学研究所，广东 广州 510080;2.广州医学院生理学教研室，广东广州 510182;3.中山大学附属第一医院CCU科，广东 广州 510080;4.广州医学院药理学教研室，广东广州 510182;5.中山大学中山医学院生理学教研室，广东 广州 510080)

血清－葡萄糖剥夺(serum＆glucose derivation，SGD)是血管闭塞后心肌缺血或梗死的病理生理机制之一。减轻SGD诱导的心肌损害对于缺血/缺氧性心肌疾病的治疗具有重要的现实意义和临床实用价值。

长期以来，氯化钴(cobalt chloride，CoCl2)被认为是一种化学性缺氧模拟剂，可造成组织细胞(包括心肌细胞)的缺血/缺氧性损伤［1］。然而，许多研究显示，CoCl2可以提高多种细胞保护基因的表达和(或)活性，如缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α、血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1以及热休克蛋白(heat shock protein，HSP)90等。Xue等［2］的研究发现，选择性上调心肌组织内HIF-1α的表达可以对抗糖尿病小鼠的心肌损害。本研究组最近的研究显示，在损伤性浓度(600 μmol·L－1)的CoCl2处理H9c2心肌细胞(H9c2细胞)的过程中，HSP90的表达明显升高［3］，这可能是一种内在的防御机制。另外，过表达HSP90可以保护猪的心脏对抗缺血/再灌注引起的损伤［4］。Budas等［5］进一步证实，HSP90诱导的心肌保护作用与活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)有关。然而，低浓度的CoCl2是否可以保护心肌细胞对抗SGD诱导的损伤以及HSP90在其中的作用尚未见报道。

为此，本文拟观察CoCl2对SGD诱导心肌细胞损伤的影响并探讨HSP90在CoCl2心肌细胞保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 CoCl2、17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素 (17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG)、双氯荧光素(2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)和罗丹明 123(rhodamine123，Rh123)购自美国Sigma-Aldrich公司，细胞计数试剂盒(cell counter kit，CCK)-8 购自日本 Dojindo Lab.，DMEM-F12培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，兔抗大鼠HSP90抗体购自美国Bio-World公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养及处理 H9c2心肌细胞由中山大学实验动物中心提供，该细胞来源于大鼠胚胎期心脏组织，在37℃、5%CO2条件下培养于含有15%胎牛血清的 DMEM-F12培养基中。SGD处理:将H9c2心肌细胞培养于不含葡萄糖的培养基中，并不加血清。CoCl2配制成不同的终浓度后，单独使用或与SGD共同作用于H9c2心肌细胞。17-AAG为HSP90的抑制剂，在SGD和CoCl2作用前1 h使用，作为预处理。

1.3 细胞存活率的检测 H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，每组4个复孔，约80%融合时，给予不同的处理因素。处理结束后，每孔加100 μl(1∶10稀释)CCK-8溶液，轻摇，37℃孵育3 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(optical density，OD)。取4孔OD值的平均数，按公式计算细胞存活率，细胞存活率/%=处理组OD/对照组OD×100%，重复3次。

1.4 细胞内活性氧含量的检测 按照文献［1］介绍的方法检测胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量。当细胞生长到约80%融合时，根据实验需要进行不同的处理:SGD单独作用2 h;SGD与CoCl2共同作用2 h;在二者作用前用2 μmol·L－117-AAG预处理1 h;CoCl2或17-AAG单独处理。处理完成后，PBS洗2次，细胞在10 μmol·L－1DCFH-DA染液中37℃孵育10 min。在荧光显微镜下随机选取3个不重复区摄片，用Image J 1.41o软件的Color Histogram模块分析DCF的平均荧光强度，其大小能反映ROS的含量。

1.5 线粒体膜电位的检测 按照文献［1］介绍的方法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)大小。当细胞生长到约80%融合时，根据实验需要进行不同的处理:SGD 24 h;SGD与CoCl2共同作用24 h;在二者作用前用 2 μmol·L－117-AAG预处理1 h;CoCl2或17-AAG单独处理。处理结束后，用PBS洗2次，在含100 μg·L－1Rh 123的无血清培养基中37℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取3个不重复区摄片，细胞核周围绿色的亮点即为摄取了Rh123的线粒体。用Image J 1.41o软件对绿色荧光强度进行半定量分析。

1.6 Western blot法检测HSP90蛋白的表达H9c2心肌细胞接种于35 mm培养皿内，约80%融合时，给予终浓度为 100 μmol·L－1的 CoCl2培养处理6、12 h及24 h;SGD与不同浓度的CaCl2共同处理24 h。处理完成后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置 30 min。12 000 r·min－1离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5 h。随后加入HSP90抗体(1∶1 000)，室温孵育2 h，用TBST洗3次，加入相应的二抗，孵育1 h，漂洗3次。ECL显色后，用Image J 1.41进行半定量分析，每样本重复3次。

1.7 统计学处理 实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，所有结果以±s表示，组间比较采用One-way ANOVA及LSD-t检验。

2 结果

2.1 CoCl2对抗SGD诱导的H9c2心肌细胞损伤

Fig 1显示，H9c2心肌细胞经SGD处理24 h，细胞存活率明显降低，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。在SGD处理同时，分别应用50～400 μmol·L－1的 CoCl2处理 H9c2心肌细胞，细胞存活率检测结果显示，50、100 μmol·L－1和 200 μmol·L－1的CoCl2可分别明显对抗SGD引起的细胞存活率降低(P ＜0.05)，100 μmol·L－1的 CoCl2在本身不改变细胞存活率的情况下(数据未显示)，具有最强的心肌细胞保护作用(P ＜0.01)，200 μmol·L－1CoCl2的心肌细胞保护作用开始减弱，400 μmol·L－1CoCl2已无心肌细胞保护作用(P＞0.05)。因而在后续的实验中选择100 μmol·L－1的 CoCl2作为有效的细胞保护浓度。

2.2 CoCl2对抗SGD引起的H9c2心肌细胞内HSP90表达下调 通过检测H9c2心肌细胞内HSP90 的表达发现，100 μmol·L－1CoCl2处理 6 ～24 h可时间依赖性地上调HSP90的表达(Fig 2 A，B)。进一步的研究显示(Fig 2 C，D)，SGD作用24 h可使H9c2心肌细胞内HSP90的表达明显降低(P＜0.05)，而在SGD处理过程中给予不同浓度的CoCl2可以不同程度地拮抗SGD诱导的HSP90表达下调，其中 50 μmol·L－1的 CoCl2处理开始增加HSP90的表达，在100μmol·L－1浓度时达到高峰，200 μmol·L－1时 HSP90 表达有所减少，但与 SGD组比较差异仍有统计学意义(P＜0.01)。此结果表明，上调HSP90的表达可能是CoCl2对抗SGD诱导心肌毒性的机制之一。

Fig 1 Effect of CoCl2on SGD-induced decrease in cell viability in H9c2 cells(n=3)

2.3 HSP90介导CoCl2对SGD诱导的心肌细胞毒性的抑制作用 为了进一步明确HSP90在CoCl2诱导的心肌细胞保护中的作用，应用HSP90的抑制剂17-AAG预处理H9c2心肌细胞。结果显示(Fig 3)，2 μmol·L－117-AAG 预处理 1 h 可明显拮抗CoCl2处理引起的细胞存活率提高，提示CoCl2保护H9c2心肌细胞对抗SGD诱导的细胞毒性至少部分地与其上调HSP90的表达有关。

2.4 HSP90参与CoCl2保护心肌细胞对抗SGD引起的ROS水平的升高 氧化应激是SGD诱导细胞损伤的重要方式，为了明确CoCl2诱导的心肌细胞保护作用是否与其改善氧化应激状态有关，本文检测胞内ROS的水平显示(Fig 4)，SGD处理2 h可明显提高H9c2心肌细胞内ROS的水平(P＜0.01)(Fig 4 A-2)，而同时给予CoCl2可拮抗胞内ROS水平的升高(P＜0.05)(Fig 4 A-3)。CoCl2本身不影响胞内ROS的水平(Fig 4 A-5)。结果提示CoCl2的心肌细胞保护作用可能与抑制ROS生成有关。进一步的研究证实，17-AAG预处理能拮抗CoCl2对ROS生成的抑制作用(Fig 4 A-4)，提示HSP90可能参与CoCl2的抗氧化作用。

Fig 2 Effects of CoCl2and SGD on the expression of HSP90 in H9c2 cells(n=3)

2.5 HSP90参与CoCl2对抗SGD引起的ΔΨm受损 Rh123染色及荧光显微镜照相的结果显示(Fig 5)，SGD处理24 h可明显抑制线粒体对Rh123的摄取，提示ΔΨm丢失线粒体功能受损(Fig 5 A-2)，而同时给予CoCl2可明显改善线粒体的功能，表现为ΔΨm升高(P＜0.05)(Fig 5 A-3)，CoCl2本身对ΔΨm没有明显的影响(Fig 5 A-5)。而在CoCl2和SGD处理前，给予17-AAG预处理能明显减弱CoCl2对ΔΨm的改善作用(Fig 5 A-4)，提示HSP90可能参与了CoCl2对线粒体功能的改善作用。

Fig 3 Effect of different treatments on cell viability in H9c2 cells(n=3)

3 讨论

缺血性器官损伤是临床常见的病理生理过程，在体外研究中可以通过SGD的方法来模拟实现［6－7］。如 Yao 等［6］在 SGD 损伤的心肌细胞上，探讨了存活素的心肌保护作用及其机制。H9c2心肌细胞来源于大鼠胚胎期的心脏组织，具有心肌细胞的许多重要特性和功能，是目前研究心肌细胞损伤与保护的常用模型。因而，本文采用 SGD处理H9c2心肌细胞可为缺血性心肌损伤的研究提供一个实用的实验模型。

本课题组的前期研究显示，800 μmol·L－1CoCl2处理H9c2心肌细胞36 h可降低细胞存活率，增加细胞凋亡率［1］。但是也有报道显示，低浓度的CoCl2处理可上调HIF-1α的表达，并促进肝细胞瘤HepG2细胞的生长［8］。而低浓度的CoCl2处理是否能保护H9c2心肌细胞对抗缺血引起的损伤，尚未见报道。本文的结果显示，100 μmol·L－1CoCl2处理可明显抑制SGD诱导的H9c2心肌细胞存活率降低，这提示低浓度CoCl2处理对心肌细胞同样具有保护作用。

Fig 4 Effect of different treatments on intracellular ROS level in H9c2 cells(n=3)

氧化应激是SGD诱导细胞损伤的一种重要机制。抗氧化剂百里醌可保护PC12神经细胞对抗SGD引起的氧化应激损伤［7］。本文研究显示，SGD处理可使H9c2心肌细胞内ROS的水平明显升高，而CoCl2处理可以明显降低细胞内的ROS水平。这和以前关于高浓度CoCl2处理引起氧化应激损伤的报道［1，3］是不一致的。其中的一个机制可能是，高浓度的CoCl2主要以诱导ROS生成为主，而低浓度的CoCl2则主要启动细胞的一些保护基因的表达，继而通过这些细胞保护基因的表达对抗氧化应激损伤，但是尚需要更多的实验证实。

Fig 5 Effect of different treatments on ΔΨm in H9c2 cells(n=3)

线粒体是缺血性细胞损伤过程中易受累的细胞器之一。ΔΨm的丢失是线粒体受损的早期表现，任何原因引起的线粒体通透性转变孔(mitochondria permeability transition pore，MPTP)的开放以及 H+跨膜梯度的降低均可导致ΔΨm丢失［9］。MPTP的开放及其引起的细胞色素C释放是引起线粒体通路介导的凋亡性细胞死亡的原因。Bialik等［10］研究发现，SGD可引起线粒体功能受损、caspase-3活化及细胞凋亡，这与本文的结果类似。重要的是，本文研究发现CoCl2处理可以减轻SGD引起的ΔΨm丢失，这可能是CoCl2保护心肌细胞的另一重要机制。

为了进一步明确CoCl2处理诱导的心肌细胞保护的分子机制，本文观察了CoCl2对H9c2心肌细胞内HSP90表达的影响。发现SGD处理可明显抑制胞内HSP90的表达，CoCl2不仅本身可以时间依赖性地促进HSP90的表达，而且还可对抗SGD引起的HSP90表达下调。进一步的研究显示，CoCl2对抗SGD对HSP90表达的抑制作用与浓度有关，在50 μmol·L－1时开始起拮抗作用，100 μmol·L－1时达到高峰，200 μmol·L－1时这种拮抗作用开始降低。Latchman等［11］认为，适度地上调HSP的表达可以发挥心肌保护作用。有研究显示［5］，过表达HSP90可以抑制缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡。HSP90可以通过稳定HIF-1α从而诱导多种细胞保护基因的表达，其机制与c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)信号通路有关［12］。重要的是，本文还观察了HSP90在CoCl2诱导的心肌细胞保护中的作用，即通过应用HSP90的选择性抑制剂17-AAG预处理H9c2心肌细胞，探讨其对CoCl2诱导的心肌细胞保护作用的影响。结果显示，抑制HSP90后，CoCl2的抗氧化作用、线粒体保护以及细胞存活率的改善作用均被明显减弱。提示低浓度CoCl2的心肌细胞保护作用至少部分地是通过促进HSP90表达而实现的，这与HSP90介导硫化氢心肌细胞保护作用的报道类似［13］。

综上所述，本文的研究首次证实，低浓度CoCl2处理具有对抗SGD引起的心肌细胞损伤的作用。上调心肌细胞内HSP90的表达可能是低浓度CoCl2诱导心肌细胞保护的重要机制之一。然而，CoCl2是通过何种机制诱导HSP90表达的，有待于在以后的实验中深入探讨。

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