黄芩苷对FM1肺炎小鼠肺损伤的作用机制研究

万巧凤，顾立刚，殷胜骏，吴 珺，邱泽计

(1.北京中医药大学中医药抗病毒教育部重点实验室，北京 100029;2.宁夏医科大学，宁夏银川 750004)

甲型流感病毒是具有高度传染性呼吸道病毒，可引起人和动物高发病率和病死率。在抗流感病毒方面，中药通过阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、抗炎等综合功效而发挥抗病毒作用。黄芩苷(Baicalin，BAI)是从黄芩(Scutellaria baicalensis)中提取的多酚羟基黄酮类单体，具有抑菌［1］、清除氧自由基［2］、抗肿瘤［3］、抗凋亡［4］等多种作用。本课题组前期做了黄芩苷体外抗流感病毒实验，表明黄芩苷对流感病毒诱导的细胞氧化应激、凋亡有抑制作用。黄芩苷(0.96～1.5 g·kg-1)对流感病毒感染导致的小鼠死亡有很好的保护作用［5］。关于黄芩苷体内抗流感病毒的作用机制国内外鲜有报道。本实验制备了小鼠甲型流感病毒性肺炎模型，通过观察肺组织病理改变、检测肺组织转录因子AP-1在基因和蛋白两个水平的表达及检测肺匀浆炎性细胞因子分泌水平，初步探讨黄芩苷抗流感病毒的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与流感病毒 ICR小鼠，清洁级，体质量13～15 g，小鼠及饲料均由北京维通利华实验中心提供，合格证号:0194690。流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1由中国中医药研究院中医所提供，于9日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后测血凝滴度为2-7。测定其对小鼠的半数致死量(LD50)为10-3.17，确定造模浓度为2倍LD50。

1.1.2 实验药品与试剂 黄芩苷，纯度92%，由辽宁中医药大学初正云教授惠赠;利巴韦林(ribavirin，RBV)颗粒，四川百利药业有限责任公司，批号100725。TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)，两步法反转录试剂盒(TaKaRa)，Agarose(Promega)，DEPC(Sigma)，DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)，引物由上海生工生物工程公司合成，c-jun一抗(bioworld，批号 360858)，P-c-jun/AP-1 一抗(bioworld，批号360756)。HRP标记山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号91664)，βactin(Invitrogen公司)，Western blot其它试剂及H-E染色材料由本室配备。ELISA试剂盒(尚柏生物医学技术北京有限公司):TNF-α(RB，货号2R602)，IL-1β(RB，货号2R432)。

1.2 方法

1.2.1 分组及肺炎模型制备 订购ICR小鼠96只，♀♂各半，随机分为正常对照组，模型组，RBV组(100 mg·kg-1)，BAI组(1500、750、375 mg·kg-1)，每组16只，将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，正常对照组以0.05 ml生理盐水滴鼻，其余各组以0.05 ml的2倍LD50FM1稀释液滴鼻。

1.2.2 药物治疗及实验样本采集 于感染后24 h开始灌胃给药，正常对照组、模型组灌同量的蒸馏水，其余各组按相应剂量给药，每天1次，共给药4 d，d 6禁食禁水8 h，摘眼球放血致死，无菌摘取全肺。每组随机取4只全肺固定于10%的甲醛溶液。其余全肺分为两半，其中一半制作肺匀浆，另一半存于液氮备用。

1.2.3 肺组织病理切片制作 将固定好的标本行石蜡包埋，切片5 μm，经H-E染色、中性树胶封固后显微镜观察照相。

1.2.4 RT-PCR检测肺组织c-jun、c-fos mRNA表达每组随机取5只小鼠肺组织进行RT-PCR定量实验。TRIzol提取各组肺组织总RNA，紫外分光光度计定量。取3 μg为模板反转录合成cDNA，以2 μl cDNA为模板进行PCR扩增。引物序列为:β-actin(385 bp):上游5'-GGT GTG ATG GTG GGA ATG-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-jun(327bp):上游 5'-CCT GCC TTT GTA AGT TAT TCC-3'，下游5'-GCA TAG CCC TCG TAG ATG G-3';c-fos(263 bp):上游5'-GAG AAT CCG AAG GGA ACG-3'，下游 5'-GGC AGA CCT CCA GTC AAA-3'，PCR反应总体积为20 μl，扩增条件:预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共30个循环后72℃延伸3 min，4℃终止反应。RTPCR产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色后用凝胶成像分析系统测定各目的条带与β-actin的IOD值，其比值为目的基因的相对表达量。

1.2.5 Western blot检测肺组织c-jun、p-c-jun蛋白表达 每组随机取5只小鼠肺组织进行Western blot实验。将肺组织样本于液氮中研磨致粉末，加入裂解液，Bradford法蛋白定量。取总蛋白40 μg，以1×样品缓冲液配平上样体积，沸水浴5 min后上样，SDS-PAGE电泳(浓缩胶80V，分离胶100V)，半干电转膜仪转膜(30 mA，90 min);封闭后分别加入c-jun、p-c-jun一抗，4℃过夜;TBS-T漂洗液洗膜10 min，共3次;加入 HRP标记的二抗，37℃振荡60 min;加入ECL发光液，X线胶片曝光，经显影、定影、扫描后观察结果。应用Image-Pro Plus软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析，各目的条带与βactin的灰度比值为目的蛋白的相对表达量。

1.2.6 肺组织匀浆TNF-α、IL-1β含量测定 将各组12只肺组织，按参考文献［6］制备肺匀浆。程序按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0软件分析。实验数据以±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 BAI对肺组织病理形态的影响 H-E染色切片光镜下观察结果:正常对照组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形态完整，肺泡壁厚度正常，支气管上皮完整，管腔内无分泌物，外周未见炎性细胞浸润。模型组呈现重度间质性肺炎病变，肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管等正常的组织结构消失，形成实变区，组织间见大量红细胞，血管内充血。RBV组和 BAI 750、375 mg·kg-1组肺泡、肺泡囊、肺泡管等肺组织形态结构较为完整，肺泡隔较正常对照组有所增厚，偶见少量的淋巴细胞的浸润及少量血管内充血;BAI 1 500 mg·kg-1组肺组织形态结构病变有所改善，但效果不明显，见Fig 1。

2.2 BAI对肺组织c-jun、c-fos mRNA表达的影响与正常对照组相比，模型组c-jun、c-fos mRNA表达明显升高(P＜0.01);与模型组比较，RBV和BAI 375 mg·kg-1组c-jun、c-fos mRNA表达降低(P＜0.01)，BAI 750 mg·kg-1组 c-jun 、c-fos mRNA 表达降低(P ＜0.05)，BAI 1 500 mg·kg-1组 c-jun 、c-fos mRNA表达降低(P＞0.05，P＜0.05)，见Fig 2。

2.3 BAI对肺组织c-jun、p-c-jun蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组c-jun、p-c-jun蛋白表达明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，RBV与BAI 750、375 mg·kg-1组 c-jun、p-c-jun 蛋白表达降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1组 p-c-jun蛋白表达降低(P＜0.05)、c-jun蛋白表达有下降趋势(P＞0.05)，见 Fig 3。

2.4 BAI对肺组织匀浆炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的影响 与正常对照组相比，模型组TNF-α、IL-1β分泌明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，RBV组及 BAI 750、375 mg·kg-1组 TNF-α 分泌降低(P＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1组 TNF-α 分泌降低(P＜0.05);RBV 组及 BAI 750、375 mg·kg-1组 IL-1β分泌降低(P ＜0.01)，BAI 1 500 mg·kg-1组 IL-1β分泌有降低趋势(P＞0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

Tab 1 Effect of BAI on the secretions of inflammatory cytokines(±s，n=12)

△△P ＜0.01 vs normal group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 TNF-α/ng·L-1 IL-1β/ng·L -1 Normal 143.32±23.72 143.33±24.53 Model 218.30±31.05△△185.98±30.71△△RBV 100 152.07±25.33* 148.56±21.33＊＊BAI 1500 186.19±17.67* 178.32±24.31 750 159.02±25.48＊＊156.69±21.38＊＊375 153.46±25.09＊＊153.61±21.90＊＊

Fig 1 Effect of BAI on the pathological structure of lung tissue infected with FM1(H-E×100)

Fig 2 Effect of BAI on mRNA expressions of c-jun and c-fos in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

3 讨论

研究表明，甲型流感病毒感染后的上皮细胞和巨噬细胞可诱导 NF-κB和AP-1活化，磷酸化 NF-κB和AP-1入核后调控下游多种生物学活性的致炎细胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 的表达［7-8］。如果病毒不能被及时清除，就会造成大量炎细胞的浸润而损伤正常细胞的结构和功能，从而引起病毒性肺炎［9］。

AP-1是细胞内重要的转录因子，属于亮氨酸拉链蛋白家族，由 jun(c-jun、junB 和 junD)、fos(c-fos、fosB、fral和fra2)组成的同型或异型二聚体，jun蛋白可以形成同源二聚体，而fos蛋白只能与jun蛋白聚合成异源二聚体［10］。在正常状态下，AP-1以同源二聚体为主且浓度和活性很低;当机体受到病原体刺激时，AP-1蛋白短时间内迅速升高，而且转变为以c-fos与c-jun异二聚体为主的存在形式，该二聚体稳定且具有与DNA结合的强大的亲和力，能与某些基因启动子TAP反应元件(TRE)或cAMP反应原件(CRE)结合而调控基因表达［11］，从而调节细胞的增值、分化和转化，参与体内免疫系统的调控、细胞凋亡的发生以及炎性细胞因子的表达等［12-13］。由于c-jun亚基是构成AP-1蛋白的结构成分之一，所以通过测定c-jun亚基的表达量便可确定AP-1蛋白的表达量，而通过测定p-c-jun含量便可确定细胞核中有活性AP-1的含量。

Fig 3 Effect of BAI on protein expressions of c-jun and p-c-jun in FM1 infected mice lung(±s，n=5)

本实验结果显示，模型组的肺组织病变很严重，c-jun、c-fos mRNA，c-jun、p-c-jun 蛋白，致炎细胞因子 TNF-α、IL-1β 分泌水平明显升高;经 BAI 750、375 mg·kg-1治疗后，肺组织病变明显改善，肺组织细胞c-jun、c-fos mRNA以及c-jun、p-c-jun蛋白表达明显下降，肺匀浆的致炎细胞因子TNF-α、IL-1β分泌水平降低。这表明BAI能通过抑制AP-1信号通路的激活来降低炎性细胞因子分泌，从而减轻病理损伤，对流感引起的肺炎有良好的治疗作用。

本实验1 500 mg·kg-1剂量的BAI作用效果不明显，可能与高剂量BAI的类抗生素作用有关。口服BAI后，其在肠道菌作用下先被水解为黄芩素，后者通过肠黏膜被吸收，再被转化成BAI。因此，BAI的口服吸收受到肠道厌氧菌群水解作用的制约［14-15］。BAI 1 500 mg·kg-1可能因浓度高引起了菌群系统的失调，从而影响了BAI的吸收效率。BAI抗甲型流感病毒的最小有效剂量将需要进一步研究确定，待后续报道。

［1］ 熊 英，傅颖媛，况南珍，等.黄芩苷抗白念珠菌作用及机制研究［J］.中国药理学通报，2004，20(12):1404-7.

［1］ Xiong Y，Fu Y Y，Kuang N Z，et al.Study on activity and mechanism of Baicalin against candida albicans［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(12):1404-7.

［2］ Aaby K，Hvattum E，Skrede G.Analysis of flavonoids and other phenolic compounds using high-performance liquid chromatography with coulometric array detection:relationship to antioxidant activity［J］.J Agric Food Chem，2004，52(15):4595-603.

［3］ 况南珍，傅颖媛，黄彬红，等.黄芩苷对人肝癌细胞系SMMC7721抑瘤作用的实验研究［J］.时珍国医国药，2008，19(6):1422-4.

［3］ Kuang N Z，Fu Y Y，Huang B H，et al.An Experimental study on inhibitory effect of baicalin on human hepatic carcinoma celline SMMC7721 in vitro［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2008，19(6):1422-4.

［4］ 万巧凤，顾立刚，殷胜骏，等.黄芩苷对FM1肺炎小鼠肺组织细胞凋亡FAS/FAS-L系统的影响［J］.中国药理学通报，2011，27(11):1555-9.

［4］ Wan Q F，Gu L G，Yin S J，et al.Effect of Baicalin on cell apoptosis FAS/FAS-L system of pneumonia mice lung tissue infected with FM1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(11):1555-9.

［5］ 初正云，初 明，滕 宇.黄芩苷体内抗流感病毒作用［J］.中国中药杂志，2007，32(22):2413-5.

［5］ Chu Z Y，Chu M，Teng Y.Effect of baicalin on in vivo anti-virus［J］.J Chin Mat Med，2007，32(22):2413-5.

［6］ 郑金粟，顾立刚.痰热清注射液对流感病毒FM1感染小鼠抗病毒作用的研究［J］.中华中医药杂志，2009，24(7):851-4.

［6］ Zheng J S，Gu L G.Study on anti-virus effect of Tan Re Qing injection on the mice with influenza virus FM1 infected［J］.China J Tradit Chin Med Pharmacy，2009，24(7):851-4.

［7］ Julkunen I，Sareneva T，Pirhonen J，et al.Molecular pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2001，12(2-3):171-80.

［8］ Kaufmann A，Salentin R，Meyer R G，et al.Defense against influenza A virus infection:essential role of the chemokine system［J］.Immunobiol，2001，204(5):603-13.

［9］ 张艳丽，范新生，李澎涛，等.毒热平注射液抗流感病毒肺损伤机制的研究［J］.宁夏医科大学学报，2010，32(1):33-5.

［9］ Zhang Y L，Fan X S，Li P T，et al.Anti viral Mechanism of dureping injection on lung injury in mice［J］.J Ningxia Med Univ，2010，32(1):33-5.

［10］何庆南.转录因子AP-1的研究进展［J］.国外医学儿科学分册，1999，26(3):152-5.

［10］ He Q N.Research progress of transcription factor AP-1［J］.Foreign Med Sci Paed，1999，26(3):152-5.

［11］ Chimenov Y，Kerppola T K.Close encounters of many kinds:Fos-Jun interactions that mediate transeription regulatory specificity［J］.Oncogene，2001，20(19):2438-52.

［12］ Liebermann D A，Gregory B，Hoffman B.AP-1(Fos/Jun)transcription factors in hematopoietic differentiation and apoptosis［J］.Int J Oncol，1998，12(3):685-700.

［13］ Shaulian E，Karin M.AP-1 as a regulator of cell life and death［J］.Nat Cell Biol，2002，4(5):131-6.

［14］刘太明，蒋学华.黄芩苷和黄芩素大鼠在体胃、肠的吸收动力学研究［J］.中国中药杂志，2006(12):999-1001.

［14］ Liu T M，Jiang X H.Studies on the absorption kinetics of baicalin and baicalein in rats’stomachs and intestines［J］.China J Chin Mater Med，2006(12):999-1001.

［15］罗海燕，宋姗姗，黄暨生，等.黄芩苷对小鼠肠道菌群影响的量-时规律观察［J］.中国医药指南，2010(32):42-9.

［15］ Luo H Y，Song S S，Huang J S，et al.Observing of Baicalin on the rats intestinal flora［J］.Guide China Med，2010(32):42-9.