TGF-β1-Samd3信号转导在星形胶质细胞增殖中的作用

余传勇，桂 韦，黄 琳，王 玉

(安徽医科大学第一附属医院神经内科，安徽合肥 230022)

在脑损伤、癫痫等多种中枢神经系统(CNS)疾病的病理生理过程中，星形胶质细胞激活并过度增生形成胶质瘢痕［1］。激活的星形胶质细胞一方面可以分泌和合成大量的细胞外基质(ECM)抑制神经轴突的生长［2］，另一方面胶质瘢痕形成机械性屏障阻碍轴索再生长，从而影响神经功能的修复［3］。此外，星形胶质细胞的增殖及胶质疤痕形成还是某些脑病，如癫痫的脑功能紊乱的病理基础［4－5］，因此对CNS胶质疤痕的深入研究具有重要意义。研究发现在脑血管疾病、癫痫等脑损伤疾病中，转化生长因子β1(TGF-β1)含量由正常生理情况下的微量表达转而明显增加［6］。本文作者 Wang 等［7］发现TGF-β1的下游转导因子Samd3基因敲除小鼠脑损伤后胶质疤痕形成明显被抑制，然而，目前尚无证据表明Samd3对胶质疤痕形成的影响系经由TGF-β1-Samd3信号转导来完成的，因为Smad3同样转导来自TGF-β家族中其它细胞因子的信号。本文通过SiRNA干扰技术，探讨TGF-β1-Smad3信号转导通路在星形胶质细胞增殖中的作用，以期从星形胶质细胞分裂增殖的角度研究CNS胶质疤痕形成的细胞内信号转导机制，为脑损伤后中枢神经系统胶质疤痕形成的干预治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体购自Doka公司，胰酶和胎牛血清均购自Hyclone公司，多聚赖氨酸和Lipofectamine2000均为Sigma公司产品，DMEM培养基购自Gibco公司，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠星形胶质细胞的培养与鉴定［8］取出生后3 d内的ICR小鼠(安徽省实验动物中心)，无菌条件下断头取出大脑皮质部分，投入HBSS中，仔细剔除中脑、嗅球、海马、脑膜及毛细血管等结构，进行星形胶质细胞的原代培养。在含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养液中，单层细胞培养，37℃5%CO2孵箱中培养1周后传代。使用兔抗GFAP对星形胶质细胞进行染色，予以鉴定，GFAP阳性细胞率超过95%。

1.2.2 实验分组及药物处理 将纯化培养的第2代星形胶质细胞用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液，以1×104/孔接种于96孔培养板中，培养48 h，观察细胞完全贴壁。将实验分4组，每组15个孔，分别加入浓度为1、5、10 μg·L－1的 TGF-β1，并设对照组，同时加入 BrdU抗原(终浓度20 μmol·L－1)培养48 h，观察TGF-β1对星形胶质细胞增殖的影响;经过同样的培养过程，将实验分4组，Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2，Smad3-SiRNA-3 及对照组，每组15孔，同时加入 BrdU抗原(终浓度20 μmol·L－1)，观察Smad3基因沉默对星形胶质细胞增殖的影响;经过同样的培养过程，将实验分5组，每组12个孔，分别加入浓度为10 μg·L－1的TGF-β1以及 Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2及 Smad3-SiRNA-3，并设 10 μg·L－1的 TGF-β1 对照以及空白对照，同时加入 BrdU抗原(终浓度20 μmol·L－1)培养48 h，观察Smad3基因沉默对TGF-β1促进星形胶质细胞增殖影响的干扰作用。

1.2.3 免疫细胞荧光直接观察细胞增殖情况 取来经TGF-β1及BrdU处理48 h后的星形胶质细胞，弃去培养液，PBS洗涤5 min，4%多聚甲醛固定30 min，2 mol·L－1盐酸暴露 BrdU 标记部位 30 min，0.3%TritonX-100通透45 min，5%羊血清封闭1 h，分别加入兔抗GFAP+大鼠抗BrdU抗体，常温孵育1 h后放入4℃冰箱孵育过夜，PBS洗涤3次，充分洗去一抗，加入荧光标记二抗:羊抗大鼠FITC+羊抗兔CY3，室温避光孵育3 h，PBS洗涤3次后，DAPI染核20 min，PBS洗涤3次，在荧光显微镜(Olympus IX71)下分别观察GFAP、BrdU和DAPI的标记情况，在荧光显微镜下，对已行GFAP、BrdU和DAPI三染的96孔板，每孔取互不重叠的4个视野，进行拍照，然后计算BrdU阳性细胞数占星形胶质细胞总数的百分比进行计数统计。增殖率计算为BrdU+GFAP+DAPI三染细胞数与GFAP+DAPI双染细胞数比值，数据以±s%表示。

1.2.4 SiRNA 沉默技术

1.2.4.1 SiRNA合成 我们根据小鼠Smad3基因编号序列特征，依照SiRNA的设计原则，由广州市锐博生物科技有限公司合成3对Smad3-SiRNA:Smad3-SiRNA-1正义链:5'CAGUUCUACCUCCAGUGUU dTdT 3'，反义链:3'dTdT GUCAAGAUGGAGGUCACAA 5';Smad3-SiRNA2正义链:5'CCAUGACAGUAGAUGGCUU dTdT 3'，反义链:3'dTdTGGUACUGUCAUCUACCGAA 5';Smad3-SiRNA-3正义链:5'CGCAGAACGUGAACACCAA dTdT 3'，反义链:3'dTdTGCGUCUUGCACUUGUGGUU 5'，对相应基因进行沉默。

1.2.4.2 Smad3-SiRNA转染入细胞 星形胶质细胞体外培养1周后，传代至6孔板及96孔板中，培养3天，细胞融合率约达到70% ～75%时进行转染，用Lipofectamine2000作载体转染Smad3-SiRNA，转染过程按转染试剂说明书进行。转染6 h后更换新鲜DMEM培养基，培养2 d后，对细胞进行固定染色并在显微镜下观察，转染效率用RT-PCR进行检测。

1.2.4.3 应用 RT-PCR技术验证基因沉默 取2代星形胶质细胞，传入6孔板，分5组，Smad3-SiRNA-1，Smad3-SiRNA-2，Smad3-SiRNA-3，TGF-β1 及对照组。用TRIzol液裂解细胞，提取mRNA，按Fermentas逆转录试剂盒操作步骤，逆转录mRNA为cDNA，再进行PCR扩增，Smad3引物序列:上游:5'-ACAAGGTCCTCACCCAGATG3'，下游:5'-TGGCGATACACCACCTGTTA 3';β-actin引物序列:上游:5'-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3'，下 游:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3';PCR体系:TaqLA酶0.5 μl，10 × buffer 2.5 μl，dNTP 4 μl，上下游引物各 1 μl，cDNA 1 μl，无酶水 15 μl，共 25 μl，反应条件:94℃ 5 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min 45 s，72℃ 7 min，共35个循环，通过凝胶成像系统进行拍照，记录结果。

2 结果

2.1 TGFβ1促进星形胶质细胞的增殖 不同浓度的 TGF-β1(1、5、10 μg·L－1)对星形胶质细胞增殖均有促进作用。BrdU+DAPI+GFAP共染为增殖细胞数，DAPI+GFAP共染为细胞总数，增殖率=增殖细胞数/细胞总数，计算增殖率。1 μg·L－1TGF-β1组增殖率为(48.19 ± 3.49)%，5 μg·L－1TGF-β1组增殖率(50.92 ±4.71)%，10 μg·L－1TGF-β1 组增殖率为(62.39±4.14)%，与对照组(34.73±1.74)%相比，明显增高，并呈现一定的剂量依赖性，即 10 μg·L－1与 1 μg·L－1比较 P ＜ 0.05，而 5 μg·L－1与 1 μg·L－1以及 10 μg·L－1相比，差异均无统计学意义(Tab 1)。

Tab 1 Effect of TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 1 Effect of TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 1 μg·L－1group

Group Percentage of BrdU incorporation/%1 μg·L －1 48.19 ±3.49*5 μg·L －1 50.92 ±4.71*10 μg·L －1 62.39 ±4.14＊＊#Control 34.73 ±1.74

2.2 Smad3-SiRNA成功沉默Samd3基因的表达PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(Fig1 A)显示，TGF-β1为阳性组，可见清晰条带;沉默组 Smad3-SiRNA-1以及Smad3-SiRNA-3的mRNA水平明显低于对照组，而Smad3-SiRNA-2与对照组相比mRNA水平无差别(Fig1 B)，表明Smad3-SiRNA-2没有沉默相关基因，而 Smad3-SiRNA-1和Smad3-SiRNA-3成功转染入细胞，并成功沉默相关基因。

2.3 Smad3-SiRNA抑制星形胶质细胞的增殖Smad3-SiRNA沉默Smad3基因后明显降低了星形胶质细胞增殖率，星形胶质细胞数量也明显减少(Fig 2)。

Fig 1 Levels of Smad3 mRNA in astrocytes exposed to various types of Smad3-SiRNA or TGF-β1

Smad3-SiRNA-1组增殖率(17.33±1.83)%、Smad3-SiRNA-3组增殖率(15.83±2.10)%与对照组增殖率(35.50±3.17)%相比，明显减低，差异有统计学意义，而Smad3-SiRNA-2组增殖率(32.00±1.73)%与对照组相比，无统计学意义(Tab 2)。

Tab 2 Effect of Smad3-SiRNA on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 2 Effect of Smad3-SiRNA on astrocyte proliferation(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Percentage of BrdU incorporation/%Smad3-SiRNA-1 17.33 ±1.83＊＊Smad3-SiRNA-2 32.00 ±1.73 Smad3-SiRNA-3 15.83 ±2.10＊＊Control 35.50 ±3.17

2.4 Smad3-SiRNA阻断TGF-β1对星形胶质细胞增殖的促进作用 Smad3基因被成功沉默后，TGF-β1+Smad3-SiRNA-1组增殖率(24.55±2.33)%、TGF-β1+Smad3-SiRNA-3 组 增 殖 率 (27.83 ±2.39)%与对照组增殖率(40.40±3.16)% 及10 μg·L－1TGF-β1组增殖率(58.64±5.32)%相比明显减低，结果差异有统计学意义;而TGF-β1+Smad3-SiRNA-2组增殖率(46.70±3.83)%与10 ng·ml－1TGF-β1组相比，结果差异无统计学意义，但与对照组相比增殖率明显增高，结果有统计学差异(Tab 3)。

Arrows indicate the cells co-labeled with GFAP，BrdU and DAPI.(Bars=100 μm)

Tab 3 Effect of Smad3-SiRNA+TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

Tab 3 Effect of Smad3-SiRNA+TGF-β1 on astrocyte proliferation(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs TGF-β1;#P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs control

Group Percentage of BrdU incorporation/%Smad3-SiRNA-1+TGF-β1 24.55 ±2.33＊＊#Smad3-SiRNA-2+TGF-β1 46.70 ±3.83△Smad3-SiRNA-3+TGF-β1 27.83 ±2.39＊＊#TGF-β1 58.64 ±5.32 Control 36.40 ±3.16

3 讨论

TGF-β参与细胞的生长、分化及组织炎症、损伤修复等多种生物学作用，具有多重生物学功能［9］，它是一种多效的多肽细胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1是细胞和组织中含量最丰富的，在大多数脑损伤的疾病中都会检测到TGF-β1 含量的明显增高［10］。TGF-β1 激活的信号通路主要有以下几种，Smads通路、MAPK(mitogen-activated protein kinase)通路、NF-κB 通路、P B kinase/AKT 通路等［11］。近年来研究表明 TGF-β1-Smad3信号转导途径是其重要的转导路径，此信号路径主要成员包括TGF-β1、相应受体、胞质蛋白 Smads、早期应答转录因子等［12］。此通路在肺纤维化、肝纤维化以及皮肤瘢痕形成中的研究已较明确，可促进成纤维细胞的过度增生、分化，促进细胞外基质的过度聚集而引起病变［11］，而其在中枢神经系统胶质细胞改变中的作用国内外尚未见报道。

本实验通过给予不同浓度的 TGF-β1(1、5、10 μg·L－1)加入体外培养的星形胶质细胞中，发现TGF-β1能明显促进星形胶质细胞增殖(P＜0.05)，并出现一定程度的浓度依赖效应。这一结果与以往的报道一致［13］，但其下游机制目前尚不明确。为了进一步研究TGF-β1是如何促进星形胶质细胞增殖，通过何种机制介导，我们应用目前在基因功能研究中重要的研究手段RNA干扰技术，RNA干扰技术有直接转染双链SiRNA和载体表达发夹RNA两种［14］，我们采用前者。成功沉默Smad3基因，干扰TGF-β1-Smad3信号转导通路后，星形胶质细胞增殖明显受到抑制。同时，我们还发现，成功沉默Smad3基因能阻断TGF-β1对星形胶质细胞增殖的促进作用，这些结果说明TGF-β1促进星形胶质细胞的增殖系通过Smad3完成信号转导的。

综上所述，本文通过沉默Smad3基因，以及加大TGF-β1的剂量，正反两方面证实TGF-β1-Smad3信号转导通路在星形胶质细胞增殖中起重要作用。由于胶质疤痕中的主体构架系由星形胶质细胞组成，由此我们可以推断该通路在胶质疤痕形成中可能起重要作用。中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞激活，一方面由损伤周围向损伤中心部位移行增殖，另一方面星形胶质细胞经由分裂而增加细胞数，在损伤中心部位形成胶质疤痕［15］，构成机械屏障从而机械性的阻碍神经元再生［3］。所以在CNS损伤后，我们可以通过对该通路进行干扰，从而阻止胶质疤痕的产生，抑制了机械屏障的形成，从而促进神经元的再生，为神经再生的基因治疗提供了理论依据。

在我们的后续工作中，我们将在体内探讨TGF-β1-Smad3信号转导通路对胶质疤痕形成的调节机制，以及进一步研究TGF-β1-Smad3信号转导通路的下游机制，为脑损伤后基因治疗减少胶质疤痕形成、促进神经再生提供理论和实践依据。

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