吡格列酮对脂多糖刺激的星形胶质细胞白介素-1β的抑制作用及机制

刘 卓，隋海娟，闫恩志，刘婉珠，金 英

(辽宁医学院1.药理学教研室，2.机能实验中心，辽宁 锦州 121001)

星形胶质细胞(astrocyte，AC)是哺乳动物中枢神经系统内分布最广泛的胶质细胞，能合成分泌多种神经递质、激素及神经营养因子，维持着神经元内外环境、免疫调节和信号转导等功能［1］。AC在致炎因素的刺激下被激活对神经元即有保护作用，也能分泌细胞毒因子、炎症因子和补体蛋白，其中一些炎症介质反过来诱导更多的小胶质细胞趋活化，另一些则导致局部的组织损伤，从而损害神经元［2－3］。现在越来越多的证据表明激活的AC引起的炎症反应、氧化应激是如阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)的重要病理机制［4］。IL-1β是激活的AC分泌的作用最强的炎症介质之一，不仅能导致神经元淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)明显表达，而且也可以加速神经纤维缠结形成。因为IL-1β可以促使tau蛋白病变的形成和发展，推测IL-1β可能是AD发展和演进的早期病理因子［5－6］。

吡格列酮 (pioglitazone，Pio)是噻唑烷二酮类药物(thiazolidinedione drugs，TZDs)中的一种，可通过激活过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receotor-γ，PPARγ)对神经细胞有直接的保护作用［7］，还能抑制神经胶质细胞的激活及中枢炎症介质的分泌［8］。本研究采用LPS损伤模型，观察Pio对培养的大鼠乳鼠皮质星形胶质细胞产生IL-1β的影响，并进一步探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 Pio由日本TaKeDa公司提供(批号:060901，纯度＞99%)，临用时用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶 解。DMSO、LPS、DMEM、胰蛋白酶(trypsin，1 ∶250)和 L-多聚赖氨酸(poly-L-lysine)均购自Sigma公司;SP600125购于厦门励远有限公司;新生胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司;磷酸化JNK1/2(Thr183/Tyr185，#9251)、磷酸化 c-Jun(Ser63，#9261)，购于Cell Signaling公司。IL-1β的ELISA试剂盒为武汉博士德生物科技有限公司产品。

1.2 大脑皮层星形胶质细胞的培养 取出生1～2 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，无菌条件下取出大脑皮层，剔除血管和软脑膜，剪碎后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化。待细胞分散后，终止消化。200目筛网过滤、离心，用完全培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为1×108～109L－1，接种在75 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。以后每3天换液1次，第9天将培养的星形胶质细胞置于水浴恒温振荡器上，37℃、260 r·min－1、18 h，舍弃含脱落细胞的细胞悬液，以去除少突胶质和小胶质细胞，仍贴壁的细胞大部分为星形胶质细胞。用0.25%胰蛋白酶溶液消化后离心，完全培养基重悬，接种于两个75 cm2培养瓶中，以传代。细胞传2～3代后进行实验。

1.3 实验分组及给药方法 取培养第2～3代星形胶质细胞接种于培养瓶或培养板，置于培养箱中培养3 d，待细胞增殖融合成单层，按加入药物不同分为① 对照组:加入0.1%的DMSO;② LPS组:LPS用培养基新鲜配置，终浓度为10 mg·L－1，作用24 h;③ Pio组:加入不同浓度的 Pio(0.1、1.0、10.0 μmol·L－1)作用1 h后再加入LPS继续作用24 h;④ SP600125 组:加入 SP600125(10.0 μmol·L－1)作用1 h后再加入LPS共同作用24 h或单独加SP600125作用24 h。

1.4 ELISA法测定星形胶质细胞上清液中IL-1β含量 星形胶质细胞传2～3代后进行分组，药物处理24 h后，收集细胞培养上清液。上清液离心，分装，－80℃冻存。根据ELISA法测定培养液中IL-1β的含量。

1.5 免疫荧光染色法检测星形胶质细胞IL-1β的表达 星形胶质细胞经药物处理后，移去培养基，用冷的PBS漂洗2次。4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。0.3%TritonX-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。3%山羊血清封闭30 min;加入IL-1β抗体(1∶100)4℃过夜，PBS漂洗后，加入TRITC标记的二抗作用2 h，PBS漂洗。荧光倒置显微镜下观察，拍照。

1.6 Western blot法检测磷酸化JNK、c-Jun蛋白表达水平 细胞经实验因素处理后，离心收集。放入预冷的裂解缓冲液中，4℃超声粉碎后，12 000×g离心30 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。用10% ～12%的SDS-PAGE分离蛋白质，电泳后将PAGE凝胶中的蛋白质电转移至PVDF膜上，取出后将膜放入3%BSA封闭液中，封闭60 min，再用TBST洗膜3次，每次10 min。将膜放入一抗中(1∶500)，4℃孵育过夜。TTBS冲洗后，将膜放入相应二抗(1∶1 000)中，室温孵育1～2 h，漂洗3次。将膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余试剂，放置化学发光凝胶系统分析仪中进行ECL化学发光，分析结果。

2 结果

2.1 Pio对LPS激活的星形胶质细胞IL-1β释放的影响 应用ELISA方法测定了星形胶质细胞上清液中IL-1β含量，结果表明LPS(10 mg·L－1)刺激后星形胶质细胞培养液中IL-1β含量明显增加，Pio(0.1，1.0 μmol·L－1和 10.0 μmol·L－1)可明显抑制LPS引起的星形胶质细胞IL-1β的产生，且随着浓度的增加，抑制作用越来越明显。SP600125可对抗LPS引起的星形胶质细胞IL-1β产生增加(P＜0.01)，说明LPS引起的IL-1β产生增加与激活JNK信号转导通路有关，单独应用SP600125对正常IL-1β无明显作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of pioglitazone and SP600125 on LPS-induced production of IL-1β in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of pioglitazone and SP600125 on LPS-induced production of IL-1β in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group Dose/μmol·L －1 IL-1β/ng·L －1 Control － 7.43 ±1.62 LPS － 181.52 ±25.28＊＊LPS+Pio1 0.1 158.98 ±22.56#LPS+Pio2 1 125.98 ±16.85##LPS+Pio3 10 106.25 ±14.62##LPS+SP600125 10 76.40 ±14.88##SP600125 10 6.49 ±2.18

2.2 免疫荧光观察Pio对LPS引起的星形胶质细胞IL-1β表达水平的影响 为了更进一步证明Pio对LPS引起的星形胶质细胞IL-1β表达水平的影响，本实验采用免疫荧光的方法进行了深入的研究。正常情况下星形胶质细胞IL-1β几乎不表达(Fig 1A)，LPS刺激后星形胶质细胞IL-1β表达水平明显增加(Fig 1B)，Pio(1.0 μmol·L－1)能明显抑制 LPS的作用，使IL-1β表达水平明显降低(Fig 1C)。

2.3 Pio对星形胶质细胞磷酸化JNK1、c-Jun蛋白水平的影响 结果显示，LPS作用于星形胶质细胞后，磷酸化 JNK1、c-Jun蛋白水平明显增加 (P＜0.01)，Pio(0.1，1.0 μmol· L－1和 10.0 μmol·L－1)可明显对抗LPS导致星形胶质细胞的磷酸化JNK1、c-Jun蛋白水平增加(P ＜0.05，P ＜0.01);但总量 JNK1(Total-JNK1，T-JNK1)、总量 c-Jun(Totalc-Jun，T-c-Jun)蛋白表达几乎没有改变(Fig 2，3)。

3 讨论

AD患者的脑内发现有明显的胶质细胞反应，老年斑周围有大量的活化的AC包裹［8］。活化的AC可分泌细胞炎症介质如 IL-1β、IL-6、TNF-α 及NO等，这些物质对神经元有毒性作用，使神经元凋亡并坏死［9－11］。其中IL-1β是细胞内和体液中发挥重要作用的炎症因子，可以通过多个环节参与神经元的损伤，包括诱导黏附分子、增加白细胞的浸润、促进NOS的合成增加，诱导氨基酸和自由基的产生，以及启动多种细胞因子级联反应［12］。在AD脑中IL-1β的大量分泌造成的炎症损伤与老年斑和神经纤维缠结的形成、营养不良性轴突的产生以及神经元胆碱能受体过度表达直接相关。

JNK信号传导通路是细胞凋亡的重要信号传导途径，常常被环境应激如紫外线和热休克以及炎症因子如IL-1β和TNF-α等激活［13－14］。JNK1是JNK信号转导通路中重要的酶，激活后能引起大量与凋亡有关的基因表达及炎症介质的释放。JNK激活后可磷酸化其下游c-Jun，c-Jun是细胞内的一个重要转录因子，可通过诱导同源或异源二聚体形成，形成活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)复合物，而上调促凋亡相关蛋白的表达发挥作用［15］。本研究用LPS刺激星形胶质细胞大量分泌IL-1β，特异性JNK阻断剂SP600125能明显抑制星形胶质细胞分泌IL-1β，表明JNK信号转导通路的激活参与了LPS诱导的星形胶质细胞分泌IL-1β增加。反过来IL-1β诱导也能激活JNK信号传导通路，促进更多的炎症因子释放，形成恶性循环反应造成炎症损伤升级，从而对神经元造成严重损伤［16］。

Fig 1 Effects of pioglitazone on LPS-induced expression of IL-1β in cultured cortical astrocytes in rats

Fig 2 Effects of pioglitazone on LPS-induced phospho-JNK1 level in astrocytes in rats(±s)

Pio是TZDs类药物，广泛用于治疗2型糖尿病，研究发现其可通过激活PPAR-γ信号转导途径发挥抗炎作用，在治疗炎症性疾病方面有很大的应用前景［17－18］。本实验表明Pio能有效降低星形胶质细胞分泌IL-1β水平，来达到对星形胶质细胞炎症损伤的保护作用，且一定范围内呈剂量依赖性。对Pio抗炎症机制的进一步探索显示，Pio能部分下调LPS引起的磷酸化JNK1、c-Jun蛋白的水平，则表明了Pio的抑制星形胶质细胞分泌IL-1β的作用与其下调JNK信号转导通路有关，而其具体的抗炎机制还有待于进一步研究。

Fig 3 Effects of pioglitazone on LPS-induced phospho-c-Jun level in astrocytes in rats(±s)

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