晚期NSCLC患者外周血中EGFR突变检测预测靶向治疗的疗效观察

孙德弢 杜开齐 朱有才

武警浙江省总队医院胸心外科，浙江 嘉兴 314000

约70%的非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）患者在确诊时已处于晚期。研究发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶结构域发生突变的NSCLC对靶向药物的敏感性大为提高[1]。对具有EGFR突变的NSCLC患者，吉非替尼比起化疗，死亡风险降低了52%，而厄洛替尼也可使50%的具有EGFR突变晚期NSCLC患者生存2年以上。但临床上由于部分患者获取病理标本有难度，所以传统EGFR突变检测方法具有局限性。外周血取材方便，通过血清检测EGFR突变，如能达到与组织检测相近的结果，那么则更有临床实际意义。2008年1月～2012年3月笔者应用高分辨溶解曲线分析 （high-resolution melting analysis，HRM）技术，探讨检测外周血EGFR突变与晚期NSCLC一线口服吉非替尼治疗的疗效之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组64例患者，其中男21例，女43例，年龄42～76岁，平均61.3岁。所有患者均为初治，经胸腹部CT、头颅核磁共振、全身骨ECT等检查，确定临床分期为Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。病理学分型：鳞癌12例，腺癌49例，非小细胞低分化癌3例。

1.2 方法

1.2.1 血浆循环DNA提取与HRM检测 经前臂静脉采集外周血液5 mL，置洁净抗凝离心管，4℃离心10 min，吸取上清液转移至1.5 mL离心管中，于4℃下离心10 min，分装后置-80℃冰箱中保存。解冻后，按高通量血液DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，溶于50 μL灭菌水中。经微量紫外可见分光光度计测定DNA纯度及含量，提取的DNA放置-20℃冰箱储存。设计上下游引物。PCR反应条件为96℃ 2 min，96℃5 s，60℃ 5 s，72℃ 25 s，45 个循环。PCR 扩增完后，扩增产物进行HRM 分析。HRM 分析条件：95℃ 5 min，40℃ 2 min，60℃1 min，然后以0.1℃/s的速度从65℃升温至95℃收集溶解曲线数据，进行实时数据分析。

1.2.2 治疗方法 对检测出存在EGFR基因突变的患者（A组）口服吉非替尼250 mg/d，服药时间最短2个月，最长32个月。对检测不存在EGFR基因突变的患者（B组）给予多烯紫杉醇加顺铂化疗，疗程4～6个。在初始治疗期间不采用其他的抗肿瘤治疗，直到肿瘤进展或患者不能耐受药物不良反应而终止治疗。对于脑转移及孤立的骨转移灶行放疗。

1.3 疗效评价标准

疗效分为完全缓解（complete remission，CR）、部分缓解（partial remission，PR）、稳定（stable disease，SD）和进展（progressive disease，PD），CR和PR要在距离首次评价至少 4周后再次确认，计算有效率（response rate，RR）和疾病控制率（disease control rate，DCR）。定期复查胸腹部CT、头颅增强MRI及全身同位素骨扫描，进行疗效判定。无进展生存期（Progressive-free survival，PFS）为患者开始治疗直至PD的时间。 RR=（CR+PR）/总数×100%。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0对实验数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法分析两组患者的生存率差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

64例患者中，有24例（37.5%）可检测出外周血EGFR突变，5例患者因各种原因未进行吉非替尼治疗，其余19例患者治疗后CR+PR为13例，RR为68.4%，DCR为73.7%，中位PFS为12.0个月；在未检出突变的40例患者中，8例患者因各种原因未进行化疗，其余32例患者化疗后CR+PR为12例，RR为37.5%，DCR为43.8%，中位PFS为7.3个月。A组的RR与B组比较，差异有统计学意义 （χ2=4.561，P=0.033），A组的 DCR与 B组比较差异有统计学意义 （χ2=4.314，P=0.038）。 经 log-rank 检验，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，A组的生存率高于 B组 （图 1）（χ2=7.406，P=0.006）。

图1 两组PFS的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

2008年被美国临床肿瘤学会列为肺癌主要进展的血清检测EGFR突变研究，成功拓展了组织取材范围，使得EGFR检测的临床实用性更强。本研究所采用的HRM检测技术原理是在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的溶解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。国内学者[2-3]应用HRM法检测肺癌患者血浆EGFR基因突变，经基因测序法验证，结果具有高度相关性。本组中有24例（37.5%）可检测出外周血EGFR突变，可能与腺癌、女性比例较高有关。

肺癌传统的化疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用，其有效率仅为30%～40%。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点进行治疗，在取得明显疗效的同时，又可以避免对正常细胞的损害。晚期NSCLC的个体化治疗将成为肺癌临床治疗的新模式。Wu等[4]研究表明EGFR突变亚组吉非替尼的无进展生存时间明显优于紫杉醇加卡铂。Sirera等[5]的研究中对EGFR敏感突变（19和21外显子突变）的患者，均给予厄洛替尼治疗，总体生存率较化疗延长了2～3倍，客观有效率远远高于常规化疗。本研究结果也表明A组的RR和DCR与B组比较差异均具有统计学意义（均P<0.05）。Kaplan-Meier生存曲线显示，A组的生存率高于B组（P<0.05）。检测EGFR基因突变对于实现个体化治疗具有重要意义，对EGFR突变状态不明的患者盲目使用这类靶向药物，会增加EGFR野生型患者的疾病进展风险。一线靶向药物选择的关键是如何更准确、方便、有效地筛选出EGFR突变患者，这是一线靶向治疗获益的基本保证。然而，临床上晚期患者病理标本获取率较低，制约了一线靶向治疗的应用。周小昀等[6]认为外周血EGFR突变检测结果与临床评估分子靶向治疗疗效较为符合。本研究结果也表明对不能够获得足够病理标本的患者通过血清检测EGFR突变状态，在治疗上具有一定的指导意义。

[1]Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy [J].Science，2004，304（5676）：1497-1500.

[2]高菲，师建国，魏金花，等.HRM法检测肺癌EGFR基因突变[J].现代肿瘤医学，2011，19（6）：1089-1092.

[3]赵瑾，彭群新，杨炳华，等.应用HRM法检测肺癌患者循环DNA中表皮生长因子受体基因突变[J].中华医学杂志，2011，19（10）：674-678.

[4]Wu YL，Chu DT，Han B，et al.Phase Ⅲ，randomized，open-label，firstline study in Asia of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer：evaluation of patients recruited from mainland China [J].Asia Pac J Clin Oncol，2012，8（3）：232-243.

[5]Sirera R，Gil M，Blasco A，et al.Retrospective analysis of the prognostic role of p16 protein inactivation in plasma in patients with locally advanced non-small cell lung cancer [J].Lung Cancer，2008 ，61（1）：104-108.

[6]周小昀，李龙芸，崔巍，等.检测肺癌患者血清游离DNA的EGFR基因点突变与 EGFR-TKI疗效的相关性分析[J].癌症进展，2011，9（1）：13-18.